五甲基槲皮素對(duì)非酒精性脂肪肝病的作用及機(jī)制.pdf

1、隨著肥胖患病人群的快速增長(zhǎng)，非酒精性脂肪肝病已成為常見(jiàn)的慢性肝病之一，其發(fā)生機(jī)制和干預(yù)措施備受關(guān)注。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，已有研究表明槲皮素可改善非酒精性脂肪肝臟病變。五甲基槲皮素（Pentamethylquercetin，PMQ）是天然多甲氧基黃酮家族的成員之一，存在于沙棘等天然植物中，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)槲皮素結(jié)構(gòu)進(jìn)行全甲基化修飾得到的PMQ相比槲皮素具有明顯的藥代動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)。PMQ已被證實(shí)的藥理作用包括抗心肌肥厚、抗代謝綜合征、抗鏈

2、脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病等，而PMQ對(duì)非酒精性脂肪肝病的作用尚有待深入探討。本研究選用谷氨酸鈉（Monosodium glutamate，MSG）誘導(dǎo)的肥胖小鼠非酒精性脂肪肝病模型以及棕櫚酸（Palmitic acid，PA）誘導(dǎo)的L02細(xì)胞脂肪變性模型，探討PMQ對(duì)非酒精性脂肪肝臟病變的作用及機(jī)制。
　　第一部分、五甲基槲皮素改善MSG肥胖小鼠非酒精性脂肪肝臟病變的作用及機(jī)制
　　目的：研究PMQ對(duì)MSG誘導(dǎo)的肥胖小鼠非酒精性脂

3、肪肝臟病變的作用及機(jī)制。
　　方法：選用健康CD-1小鼠雌鼠和雄鼠各若干只（10周齡），適應(yīng)性喂養(yǎng)2周；至12周齡時(shí)，按一雄兩雌進(jìn)行配種。乳鼠出生后第2天起，連續(xù)7天皮下注射MSG造模，正常對(duì)照組（Control）皮下注射等體積生理鹽水；3周齡時(shí)斷乳分籠，5周齡時(shí)選取雄性 MSG造模小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組10只：溶劑對(duì)照組（Vehicle），低、中、高劑量PMQ組（PMQ5、10、20mg/kg），陽(yáng)性藥物對(duì)照組（二甲雙胍，MET

4、300mg/kg），分別予以灌胃給藥，每天一次，直至小鼠滿24周齡。每周定期稱量小鼠體重，至小鼠22周齡時(shí)進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)；24周齡時(shí)測(cè)量各組小鼠體重、腰圍，經(jīng)眼眶靜脈叢采血后處死動(dòng)物，獲取相應(yīng)組織器官。檢測(cè)血清血糖、胰島素、甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（Serum Aspartate aminotransferase，AST），血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（S

5、erum Alanine aminotransferase，ALT）水平，檢測(cè)肝臟TG和TC含量；行肝臟組織病理切片進(jìn)行HE染色、油紅O及Masson三色染色；RT-PCR方法檢測(cè)肝臟相關(guān)基因的表達(dá)水平；Western blot方法檢測(cè)肝臟相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1）與Control組相比，MSG組小鼠明顯肥胖，體重、腰圍、Lee指數(shù)顯著增加；糖脂代謝出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為空腹血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、血清T

6、G及TC水平顯著上升；肝臟油紅O和HE染色顯示有脂質(zhì)蓄積和肝細(xì)胞脂肪變性，Masson三色染色顯示無(wú)明顯纖維化改變；肝臟TG和TC含量顯著增加，血清ALT和AST水平明顯升高。
　　2）與Vehicle組比，各劑量PMQ給藥組小鼠肥胖狀態(tài)得到明顯改善，體重、腰圍、Lee指數(shù)顯著下降；空腹血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、血清TC、TG、LDL-C水平以及血清 ALT、AST水平顯著降低；肝臟TG和TC含量顯著下降；肝臟油紅O和HE

7、染色顯示脂質(zhì)聚集明顯減少，肝細(xì)胞脂肪變性緩解；PMQ各劑量組肝臟PGC-1α mRNA表達(dá)水平明顯升高，F(xiàn)ASN、CD36 mRNA水平也不同程度地下降；PMQ可顯著上調(diào)Sirt6 mRNA和蛋白表達(dá)水平，增加肝臟 p-AMPK蛋白表達(dá)，顯著下調(diào) SREBP-1c、SREBP-2、PCSK9 mRNA水平。
　　第二部分、五甲基槲皮素改善棕櫚酸誘導(dǎo)的L02細(xì)胞非酒精性脂肪變性的作用及機(jī)制
　　目的：研究PMQ對(duì)PA誘導(dǎo)的L0

8、2細(xì)胞非酒精性脂肪變性的作用機(jī)制。
　　方法：培養(yǎng)L02細(xì)胞，篩選出既不影響細(xì)胞活力又可降低細(xì)胞葡萄糖消耗的PA濃度，以此濃度PA制備L02細(xì)胞脂肪變性模型。用96孔板培養(yǎng)L02細(xì)胞，用含10％胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后換成含1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h以同步化，再換為含DMSO、PMQ（1、3、10μM）以及MET（100μM）的1640培養(yǎng)基（含一定濃度PA）繼續(xù)培養(yǎng)，并加設(shè)不含PA的DMSO對(duì)照組。細(xì)

9、胞培養(yǎng)24h后，檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞葡萄糖消耗量、TG含量；RT-PCR方法檢測(cè)FASN和CD36 mRNA表達(dá)水平；Western blot方法檢測(cè)Sirt6蛋白水平。
　　結(jié)果：1）與對(duì)照組相比，PA組細(xì)胞葡萄糖消耗下降、細(xì)胞TG含量升高，F(xiàn)ASN、CD36 mRNA表達(dá)水平增加，Sirt6蛋白水平下降。
　　2）與PA組相比，PMQ劑量依賴性地增加細(xì)胞葡萄糖消耗量，降低細(xì)胞 TG含量；高濃度 PMQ顯著降低FASN、CD