β-淀粉樣肽40-42與2型糖尿病大血管病變及血管內(nèi)皮損傷的關(guān)系.pdf

1、目的:2型糖尿?。═ype2Diabetesmellitus，T2DM）血清能損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVECs)，同時(shí)伴有上清中（Amyloid-β，Aβ）40和Aβ42水平的升高，而Aβ40可誘導(dǎo)HUVECs損傷。本研究為進(jìn)一步探討Aβ40和Aβ42與T2DM大血管病變的關(guān)系，及Aβ42對(duì)血管內(nèi)皮損傷的作用和機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.選取T

2、2DM患者78例，分為單純T2DM組（IsolatedT2DMgroup,IDM組）(n=38)和T2DM合并大血管病變組（T2DMwithMacroangiopathygroup,DMA組）（n=40）;選取健康對(duì)照組（HealthControlgroup，HC組）(n=40)。所有研究對(duì)象入組后均進(jìn)行全面的體格檢查，測(cè)量身高、體重、腰圍(waistcircumference，WC)、收縮壓(SystolicBloodPressure

3、，SBP)和舒張壓(diastolicbloodpressure，DBP)，計(jì)算體重指數(shù)(bodymassindex，BMI);隔夜空腹12h采肘靜脈血，測(cè)定空腹靜脈血漿葡萄糖(fastingplasmaglucose，F(xiàn)PG)、糖化血紅蛋白A1C(glycosylatedhemoglobinA1C，HbA1C)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerid，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(lowde

4、nsitylipoproteincholesterol，LDL-C);ELISA法測(cè)定血清Aβ40、Aβ42。
　　 2.Aβ42誘導(dǎo)HUVECs損傷30min、3h、3d后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法檢測(cè)3d時(shí)Aβ42（0.005μM、0.05μM、0.5μM、5μM、50μM）作用細(xì)胞的增殖情況，并從中篩選出最適損傷濃度。
　　 3.

5、分別用終濃度為0.5μM和5μM的Aβ42誘導(dǎo)HUVECs損傷30min、3h、3d，留取各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，化學(xué)比色法測(cè)定乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)活性、硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(maleicdialdehyd，MDA)含量、黃嘌呤氧化酶法測(cè)定總超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活力、硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮(nitricoxide，NO)含量。
　　 4

6、.取各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用Realtime-RTPCR法檢測(cè)晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptorforadvancedglycationend-products，RAGE)mRNA表達(dá)水平、WesternBlot法檢測(cè)RAGE蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組間臨床資料比較:IDM組FPG(P=0.000)、HbA1C(P=0.002)、BMI(P=0.012)、WC(P=0.006)高于HC組，DMA組F

7、PG(P=0.000)、HbA1C(P=0.003)、BMI(P=0.000)、WC(P=0.000)、SBP(P=0.000)、DBP(P=0.000)、TC(P=0.010)、TG(P=0.000)、LDL-C(P=0.001)高于HC組，DMA組FPG(P=0.004)、WC(P=0.005)、SBP(P=0.000)、DBP(P=0.001)、TG(P=0.000)、LDL-C(P=0.016)高于IDM組。
　　 各組

8、間血清Aβ40、Aβ42水平比較:與HC組比較，IDM組(P=0.002)和DMA組(P=0.000)Aβ40水平均升高，且DMA組Aβ40水平高于IDM組(P=0.000);Aβ42在各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:對(duì)照組為正常內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，呈多角形，細(xì)胞邊界清楚，細(xì)胞融合成片，呈單層鋪路石狀排列。30min和3h時(shí)各組細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，3d時(shí)Aβ4250μM組可見細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞間隙

9、增大，細(xì)胞邊界較模糊，細(xì)胞胞體腫脹，細(xì)胞排列紊亂，其他濃度組未見明顯變化。
　　 3.3d時(shí)各濃度組細(xì)胞生存率:與正常對(duì)照組比較，0.005μM組和0.05νM組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，0.5μM、5μM和50μM組細(xì)胞生存率均明顯下降(P=0.000)，以50μM組下降為著;0.05μM組和0.005μM組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);0.5μM組和5μM組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);50μM組與其

10、他各組比較細(xì)胞生存率均顯著下降(P=0.000)，但生存率過低，故本研究選用0.5μM和5μM用于內(nèi)皮損傷效應(yīng)評(píng)定。
　　 4.LDH活性:相同時(shí)間點(diǎn)各組間比較:30min時(shí)，各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3h時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=0.001)和5μM組(P=0.000)LDH活性均明顯升高，以5μM組升高為著;3d時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=0.000)和5μM組(P=0.000)LDH活性均

11、明顯升高，以5μM組升高為著。3h和3d時(shí)，與0.5μM組比較，5μM組LDH活性均升高(P=0.034，0.004)，呈一定的濃度依賴性。
　　 相同濃度組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較:對(duì)照組內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);0.5μM組內(nèi)，3h較30minLDH活性升高(P=0.000)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.018)LDH活性均明顯升高;5μM組內(nèi)，3h較30minLDH活性升高(P=0.0

12、00)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.002)LDH活性均明顯升高。0.5μM組和5μM組，隨著時(shí)間延長(zhǎng)LDH活性升高呈一定的時(shí)間依賴性。
　　 5.MDA含量:相同時(shí)間點(diǎn)各組間比較:30min時(shí)，各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3h時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=0.001)和5μM組(P=0.000)MDA含量均明顯升高，以5μM組升高為著;3d時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=0.000

13、)和5μM組(P=0.000)MDA含量均明顯升高，以5μM組升高為著。3h和3d時(shí)，與0.5μM組比較，5μM組MDA含量均升高(P=0.018，0.022)，呈一定的濃度依賴性。
　　 相同濃度組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較:對(duì)照組內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);0.5μM組內(nèi)，3h較30minMDA含量升高(P=0.032)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.000)MDA含量均明顯升高;5μM組內(nèi)，

14、3h較30minMDA含量升高(P=0.000)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.000)MDA含量均明顯升高。0.5μM組和5μM組，隨著時(shí)間延長(zhǎng)MDA含量升高呈一定的時(shí)間依賴性。
　　 6.SOD活力:相同時(shí)間點(diǎn)各組間比較:30min時(shí)，各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3h時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=0.003)和5μM組(P=0.000)SOD活力均明顯下降，以5μM組下降為著;3d時(shí)，

15、與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=0.000)和5μM組(P=0.000)SOD活力均明顯下降，以5μM組下降為著。3h和3d時(shí)，與0.5μM組比較，5μM組SOD活力均下降(P=0.042，0.023)，呈一定的濃度依賴性。
　　 相同濃度組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較:對(duì)照組內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);0.5μM組內(nèi)，3h較30minSOD活力下降(P=0.003)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.

16、001)SOD活力均明顯下降;5μM組內(nèi)，3h較30minSOD活力下降(P=0.000)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.001)SOD活力均明顯下降。在0.5μM組和5μM組內(nèi)，隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)SOD活力下降呈一定的時(shí)間依賴性。
　　 7.NO含量:相同時(shí)間點(diǎn)各組間比較:30min時(shí)，各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3h時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=0.000)和5μM組(P=0.000)N

17、O含量均明顯下降，以5μM組下降為著;3d時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=0.000)和5μM組(P=0.000)NO含量均明顯下降，以5μM組下降為著。3h和3d時(shí)，與0.5μM組比較，5μM組NO含量均下降(P=0.000，0.047)，呈一定的濃度依賴性。
　　 相同濃度組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較:對(duì)照組內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);0.5μM組內(nèi)，3h較30minNO含量下降(P=0.000)，3d較3

18、0min(P=0.000)和3h(P=0.000)NO含量明顯下降;5μM組內(nèi)，3h較30minNO含量下降(P=0.000)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.000)NO含量均明顯下降。0.5μM組和5μM組，隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)NO含量下降呈一定的時(shí)間依賴性。
　　 8.RAGEmRNA的表達(dá):相同時(shí)間點(diǎn)各組間比較:30min時(shí)，各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3h時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=

19、0.038)和5μM組(P=0.000)RAGEmRNA表達(dá)均增強(qiáng)，以5μM組為著;3d時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM(P=0.000)和5μM組(P=0.000)RAGEmRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，以5μM組為著。3h和3d時(shí)，與0.5μM組比較，5μM組RAGEmRNA表達(dá)均增強(qiáng)(P=0.025，0.000)，呈一定的濃度依賴性。
　　 相同濃度組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較:對(duì)照組內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);0.5μM

20、組內(nèi)，3h和30min比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.000)RAGEmRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng);5μM組內(nèi)，3h較30minRAGEmRNA表達(dá)增強(qiáng)(P=0.003)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.000)RAGEmRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)。0.5μM組和5μM組，隨著時(shí)間延長(zhǎng)RAGEmRNA表達(dá)增強(qiáng)呈一定的時(shí)間依賴性。
　　 9.RAGE蛋白的表達(dá):相同時(shí)間

21、點(diǎn)各組間比較:30min時(shí)，各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3h時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM組(P=0.000)和5μM組(P=0.000)RAGE表達(dá)均增強(qiáng)，以5μM組為著;3d時(shí)，與對(duì)照組比較，0.5μM(P=0.000)和5μM組(P=0.000)RAGE表達(dá)均明顯增強(qiáng)，以5μM組為著。3h和3d時(shí)，與0.5μM組比較，5μM組RAGE表達(dá)均增強(qiáng)(P=0.002，0.000)，呈一定的濃度依賴性。
　　 相同濃度

22、組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較:對(duì)照組內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);0.5μM組內(nèi)，3h較30minRAGE表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P=0.000)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.000)RAGE表達(dá)均明顯增強(qiáng);5μM組內(nèi)，3h較30minRAGE表達(dá)增強(qiáng)(P=0.000)，3d較30min(P=0.000)和3h(P=0.000)RAGE表達(dá)均明顯增強(qiáng)。0.5μM組和5μM組，隨著時(shí)間延長(zhǎng)RAGE表達(dá)增強(qiáng)呈一定的時(shí)

23、間依賴性。
　　 結(jié)論:
　　 1.T2DM患者血清中Aβ40水平升高，T2DM合并大血管病變患者的Aβ40水平升高更為顯著。Aβ40可能參與了T2DM及其大血管病變的發(fā)生、發(fā)展過程。
　　 2.Aβ42對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有損傷作用，表現(xiàn)在LDH釋放增加、MDA生成增多、SOD活力下降以及NO合成減少，且呈現(xiàn)一定的濃度、時(shí)間依賴性，損傷機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。
　　 3.Aβ42誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的同時(shí)伴有RAGE