熟地提取物通過調(diào)節(jié)SDF-1α-CXCR4信號途徑活化內(nèi)皮祖細胞保護梗死心肌的研究.pdf

1、背景：
　　 內(nèi)皮廣泛存在于人體各級動、靜脈及毛細血管內(nèi)膜表層，對維持血管的正常功能起著重要的作用。從胚胎時期的血管發(fā)生形成原始血管網(wǎng)到成年后的生理狀態(tài)下的血管內(nèi)皮代謝及病理狀態(tài)下的血管內(nèi)皮修復，內(nèi)皮細胞的作用貫穿于這一系列生理、病理過程的始終。內(nèi)皮細胞的損傷及功能紊亂導致了心、腦、腎等重要臟器血管性疾病的發(fā)生、發(fā)展，并與其預后直接相關(guān)。
　　 內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogenitorcellsEPCs)作

2、為內(nèi)皮細胞的前體，最早由Asahara等發(fā)現(xiàn)，并于2002年定義為一種陽性表達CD34、CD133、VEGFR2，且可與荊豆凝集素(UEA-1)和乙?；兔芏戎鞍?acLDL)特異性結(jié)合的具有部分內(nèi)皮功能和分化能力的單個核細胞群。內(nèi)皮祖細胞(EPCs)來源于骨髓，存在于體循環(huán)中，它既能循環(huán)、增殖、遷移、分化為成熟的內(nèi)皮細胞參與血管再生，也能夠結(jié)合在血管內(nèi)皮層，刺激鄰近內(nèi)皮細胞的增殖。許多內(nèi)皮祖細胞激動劑，如粒細胞集落刺激因子，血管內(nèi)皮

3、生長因子和他汀類藥物，已被證實可以激活內(nèi)皮祖細胞，然而這些EPC激動劑的各種不良反應，如血管通透性增加、再狹窄率升高以及嚴重的肝功能損害等，嚴重限制了它們在臨床治療中的應用。
　　 熟地黃是一種沿用千年的傳統(tǒng)中藥，味甜、甘，性溫。歸肝經(jīng)、腎經(jīng)，有補血滋潤、益精填髓之功效?？捎糜谥委熝撐S、眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)、崩不止，肝腎陰虧、潮熱盜汗、遺精陽痿、不育不孕，腰膝酸軟、耳鳴耳聾、頭目昏花、須發(fā)早白，消渴、便秘、腎虛喘促等癥。在現(xiàn)代

4、醫(yī)學研究中，熟地黃提取物(RehmanniaglutinosaextractRGE)被證實可以促進造血干細胞的增殖、分化，并促進骨髓DNA含量的增加。由此，我們假設:在生理狀態(tài)下，熟地提取物RGE是否可作用于內(nèi)皮祖細胞，從而達到其“補骨填髓”之功效。
　　 目的：
　　 1、掌握熟地提取物灌胃全身給藥方法，觀察不同濃度熟地提取物灌胃在不同時間點對生理狀態(tài)下大鼠循環(huán)和骨髓內(nèi)皮祖細胞作用變化
　　 2、篩選最佳給藥濃

5、度和作用時間，為后期實驗提供基礎。探索內(nèi)皮祖細胞的體外分離、誘導培養(yǎng)、鑒定及功能檢測方法。
　　 方法：
　　 1、地黃提取物的制備
　　 熟地黃粗粉經(jīng)反復水溶、醇提得到地黃粗多糖，并以Sevag法去除蛋白純化為地黃多糖，并檢測其濃度、純度、提取率。
　　 2、實驗分組
　　 80只雄性WISTAR大鼠隨機分為對照組(20只)，RGE低濃度組(20只，0.38g/kg·d)，RGE中濃度組(20只

6、，0.75g/kg·d)，RGE高濃度組(20只，1.5g/kg·d)。各組分別于3天、4周、8周、12周、16周取外周血，于4周、8周、12周、16周處死動物取骨髓。
　　 3、內(nèi)皮祖細胞分離、培養(yǎng)
　　 取大鼠外周血及骨髓，用密度梯度法以淋巴細胞分離液Ficoll分離出單個核細胞，以4～5×107的細胞密度將單個核細胞平鋪于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，用加入了誘導因子的培養(yǎng)基EBM-2誘導培養(yǎng)。
　　 4、內(nèi)皮

7、祖細胞鑒定
　　 貼壁的細胞用DiL-acLDL和FITC-UEA-1標記，DAPI染核，熒光共聚焦顯微鏡下觀察，DiL-acLDL和FITC-UEA-1雙表達的細胞記作EPCs。
　　 5、內(nèi)皮祖細胞計數(shù)
　　 分離出的單個核細胞與CD34、CD133、VEFFR2一抗分別孵育，后再與之相對應的二抗:IgG-PerCP-Cy5.5、IgG-F(ab)2-PE、IgG-FITC孵育。流式細胞儀分析細胞群中三種標志

8、物陽性表達的細胞數(shù)。
　　 6、內(nèi)皮祖細胞功能檢測
　　 (1)增殖功能檢測:MTT法檢測EPCs增殖能力。
　　 (2)遷移功能檢測:Transwell小室法檢測EPCs遷移能力。
　　 (3)成管功能檢測:Matrigel膠輔助下檢測EPCs管腔結(jié)構(gòu)的形成能力。
　　 7、統(tǒng)計學分析
　　 統(tǒng)計學處理數(shù)量資料以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，所有數(shù)據(jù)用軟件SPSS11.5進行統(tǒng)計分析。

9、兩組間數(shù)據(jù)的比較采用獨立樣本的t檢驗，多組之間的比較用單因素方差分析。多組間的兩兩比較用費希爾的LSD法。當P＜0.05，認為有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、實驗動物的一般情況
　　 80只雄性WISTAR大鼠，5～6周齡，體重在160～180克，普通飲食，正常晝夜節(jié)律，適應性喂養(yǎng)3天，頸動脈取外周血。經(jīng)口灌胃給藥，分為RGE低、中、高三個濃度組和對照組。每日每只大鼠灌胃藥物劑量為1ml，每周根據(jù)體重變化

10、調(diào)整給藥濃度，對照組每日生理鹽水1ml灌胃。各組大鼠健康狀況正常，試驗中無自然死亡。
　　 2、流式細胞術(shù)分析內(nèi)皮祖細胞數(shù)量
　　 流式細胞儀分析結(jié)果顯示，與對照組相比，各藥物組外周血和骨髓EPCs數(shù)量隨灌藥時間的延長而增加。在外周血:8周末，中、高劑量組EPCs增加量較對照組有統(tǒng)計學意義(P＜0.01～0.05);12周末和16周末，三種劑量的RGE灌胃均使EPCs較對照組顯著增多(P＜0.01)，但各劑量組12至16

11、周的增長速率(8.53％、1.57％、1.79％)明顯低于8至12周的增長率(10.43％、12.84％、16.50％)。在骨髓:8周末，中、高劑量組EPCs數(shù)量較對照組有增加(P＜0.05);12周末和16周末，三種劑量的RGE灌胃均使EPCs較對照組顯著增多(P＜0.01)，各組8至12周增長速率為正(6.95％、12.10％、17.14％)然而12至16周增長速率明顯下降（高濃度組3.34％）或增長停滯（低、中濃度組）。
　

12、　 3、外周血內(nèi)皮祖細胞功能檢測
　　 外周血分離單個核細胞，培養(yǎng)基EBM-2誘導培養(yǎng)48h換液，上清中的未貼壁細胞離心后重新加入，再經(jīng)過一個48h后棄去不貼壁細胞，繼續(xù)誘導培養(yǎng)48h。培養(yǎng)瓶內(nèi)的EPCs以胰酶消化并計數(shù)，備用功能檢測。
　　 (1)增殖功能檢測
　　 體外誘導培養(yǎng)6天的外周血EPCs用MTT法檢測細胞增殖能力。在16周末，中、高濃度組增殖能力與對照組相比有所升高(P＜0.05)，與各組4周末數(shù)

13、據(jù)相比亦有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。其余時間點各組增值能力無統(tǒng)計學差異。
　　 (2)遷移功能檢測
　　 Transwell小室法用于檢測體外培養(yǎng)6天的外周血EPCs的遷移能力?？梢?2周末，中、高濃度組可使遷移能力相較對照組和各組的4周末數(shù)據(jù)有所增高(P＜0.05)，但這種數(shù)量變化不明顯，且從12周末到16周末這種增殖能力沒有進一步的增長。
　　 (3)成管功能檢測
　　 體外培養(yǎng)6天的外周血EPCs

14、平鋪于Matrigel膠預孵育的96孔板上，檢測EPCs管狀結(jié)構(gòu)形成能力。高濃度組在8周末相較于4周末城管能力有所增長(P＜0.05)，12周末成管能力的增高與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。低、中、高濃度組在16周末成管能力相較于對照組均有顯著增高(P＜0.05)，與各組4周末數(shù)據(jù)相比較亦有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 4、骨髓內(nèi)皮祖細胞功能檢測
　　 骨髓PBS懸濁液中分離單個核細胞，培養(yǎng)基EBM-2誘

15、導培養(yǎng)48h換液，傳代，與上清液中分離出的未貼壁細胞共培養(yǎng)，48h后換液，棄上清，繼續(xù)誘導培養(yǎng)4天。培養(yǎng)瓶內(nèi)的EPCs以胰酶消化并計數(shù)，備用功能檢測。
　　 (1)增殖功能檢測
　　 體外誘導培養(yǎng)6天的骨髓EPCs用MTT法檢測細胞增殖能力。在12周末，中、高濃度組增殖能力與對照組相比有所升高(P＜0.05)，與各組4周、8周末數(shù)據(jù)相比亦有所增加(P＜0.05)。16周末，這種增值能力的增長進一步加劇(P＜0.01)。<

16、br>　　 (2)遷移功能檢測
　　 Transwell小室法用于檢測體外培養(yǎng)6天的骨髓EPCs的遷移能力。12周末和16周末，三種濃度的藥物刺激組遷移能力相較于對照組和各組4周末數(shù)據(jù)均有所增加(P＜0.05)，然而這種增長并不明顯。
　　 (3)成管功能檢測
　　 體外培養(yǎng)6天的骨髓EPCs平鋪于Matrigel膠預孵育的96孔板上，檢測其管狀結(jié)構(gòu)形成能力。12周末，中、高濃度組EPCs成管功能的增高與對照組

17、相比有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在16周末，這種相比對照組成管功能的增長更加明顯(P＜0.01～0.05)，且相對于各組4周末數(shù)據(jù)已有所增長(P＜0.01～0.05)。這種變化在高濃度組更加顯著(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1、在正常生理條件下，三種不同濃度的熟地提取物溶液灌胃喂養(yǎng)成年雄性大鼠，均可導致大鼠體內(nèi)EPCs數(shù)目的增多。相較于外周血來源的EPCs，骨髓來源EPCs的這種效應更為明顯。且三種藥物濃度中

18、高濃度組作用較為突出，增長速率在灌胃后的12周左右達到最大。
　　 2、在生理條件下，RGE灌胃可活化大鼠外周血和骨髓中EPCs的功能。但這種活化作用在外周血EPCs中表現(xiàn)多不顯著。在骨髓中，EPCs的活化多發(fā)生于灌胃后的12周左右。
　　 第二部分、熟地提取物通過激活內(nèi)皮祖細胞對心梗模型大鼠缺血心肌的保護作用
　　 背景：
　　 心肌梗死(myocardialinfarction)是指在冠狀動脈病變的基

19、礎上，冠狀動脈的血流中斷，使相應的心肌出現(xiàn)嚴重而持久地急性缺血，最終導致心肌的缺血性壞死。因此，血管再通及建立有效的側(cè)支循環(huán)是挽救缺血心肌，改善心肌梗死預后及降低死亡率的首要措施。越來越多的證據(jù)表明細胞移植和治療性血管再生是治療終末期冠狀動脈疾病所致心肌梗死的最具潛力和研究意義的新方法。近年來的研究顯示:骨髓來源的干細胞分化形成的內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogenitorcells，EPC)可在心梗后動員、遷移、歸巢到損傷部

20、位，并促進缺血區(qū)血管的新生，從而有效保護梗死后的心肌。近年來對熟地的現(xiàn)代醫(yī)學作用研究顯示，熟地可有效促進血細胞和骨髓增殖，治療心腦血管缺血性疾病。然而研究方法的陳舊、手段的單一、機制探討的膚淺限制了熟地在臨床上的推廣，且目前為止尚未有研究將熟地的作用機制與內(nèi)皮祖細胞相連。
　　 血管發(fā)生和血管生成是新血管形成的兩種基本形式。血管發(fā)生是指胚胎中的成血管細胞向內(nèi)皮細胞系分化包繞形成原始血管網(wǎng)并最終分化成熟形成心血管系統(tǒng);血管生成是指

21、從在原有血管網(wǎng)基礎上，通過內(nèi)皮細胞遷移、增殖、伸展及管狀結(jié)構(gòu)形成等步驟最終長成新生毛細血管的復雜過程。成熟個體中的血管再生主要通過新毛細血管的生成得以實現(xiàn)。參與成熟個體中血管再生的細胞為內(nèi)皮祖細胞。因此內(nèi)皮祖細胞成為當今醫(yī)療領域中治療缺血性疾病的研究焦點，尤其是在治療心肌梗死中成為新的治療靶點。生理狀態(tài)下，外周血中的EPCs數(shù)量較少，而骨髓中的EPCs多處于相對靜息狀態(tài);心梗發(fā)生后在急性期內(nèi)，骨髓中的EPCs被動員到外周血中，活化并歸巢

22、到損傷部位，通過參與損傷部位血管的新生維持損傷部位的血供。
　　 我們由實驗Ⅰ證實了熟地提取物在生理狀態(tài)下對內(nèi)皮祖細胞的動員作用，由此我們做出推斷:熟地提取物是否可以動員心梗條件下體內(nèi)的EPC從而達到保護受損心肌，治療心肌梗死的作用。本實驗中我們針對這一假設展開實驗。
　　 目的：
　　 1.建立大鼠心肌梗死模型，探討中藥熟地黃在心梗的急性期和慢性期對大鼠缺血心肌的保護作用。
　　 2.觀察心梗后大鼠外周

23、血和骨髓中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量、功能變化，探討內(nèi)皮祖細胞在急性期和慢性期對心梗的治療作用，并觀察熟地對內(nèi)皮祖細胞這一作用的影響。
　　 方法:
　　 1.實驗動物
　　 120只雄性WISTAR大鼠(8周齡，體重180～200g)隨機分為兩組（每組60只）:空白組生理鹽水1ml/d灌胃，試驗組熟地提取物生理鹽水溶液1.5g/kg·d灌胃。
　　 兩組分別灌胃8周后，每組又隨機分為對照組（16只，不手術(shù)），假手

24、術(shù)組（16只，手術(shù)開胸穿線不結(jié)扎），心梗組（28只，行冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)）。至此實驗大鼠分為6組:生理鹽水對照組(N-b，16只)、生理鹽水假手術(shù)組(N-m，16只)、生理鹽水心梗組(N-MI，28只)、熟地對照組（RGE-b，16只）、熟地假手術(shù)組（RGE-m，16只）、熟地心梗組(RGE-MI，28只)。
　　 術(shù)后繼續(xù)灌胃喂養(yǎng)4周，分別于術(shù)后第3天，1周末，2周末，4周末處死各組4～7只大鼠。
　　 2.心梗模型

25、的建立
　　 法一:大鼠用2.5％的戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位將大鼠固定在手術(shù)臺上，剪除胸部被毛。胸骨左側(cè)3～4肋間心尖搏動最明顯處橫向剪開胸部皮膚約1.5～2cm，鈍性分離皮下組織、胸大肌、前鋸肌。順肋間肌紋理鈍性撐開3～4肋間，可見搏動的心尖，在心尖以上0.5cm處快速穿過可吸收縫合線，閉合式結(jié)扎。對合前鋸肌、胸大肌，胸部皮膚縫合前輕擠壓縫合口排出胸腔氣體，縫合皮膚切口。皮下注射青霉素8萬IU/kg常規(guī)

26、抗感染。
　　 法二:乙醚吸入式麻醉大鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺上，剪除頸部及胸部被毛。縱向剪開大鼠頸部皮膚約1.5～2cm，分離皮下組織及肌肉，鈍性分離氣管，于氣管環(huán)之間剪開氣管半周。行氣管插管，連接呼吸機，調(diào)整呼吸頻率、呼吸比和潮氣量。胸骨左緣3mm處縱向剪開皮膚約4cm，鈍性分離皮下組織、胸大肌、前鋸肌。于第三肋間剪開肋間肌暴露胸膜。撐開肋骨，于呼氣相刺破胸膜，暴露心臟。在肺動脈圓錐與左心耳交界下方2mm處以可吸收縫合線結(jié)扎冠

27、狀動脈前降支。逐層縫合肌肉和皮膚。大鼠蘇醒后拔除氣管插管，清理氣道血塊及分泌物。對合頸部肌肉及皮下組織，縫合皮膚切口。皮下注射青霉素8萬IU/kg常規(guī)抗感染。
　　 假手術(shù)組手術(shù)步驟同上，冠狀動脈處穿過結(jié)扎線但不打結(jié)。
　　 3.存活率分析
　　 保留存活記錄并繪制生存曲線。
　　 4.心電圖及超聲心動圖檢測
　　 所有大鼠于術(shù)前和術(shù)中進行心電圖監(jiān)測，顯示即時心功能情況。大鼠于術(shù)前和心梗后3天、1

28、周、2周、4周，處死之前行經(jīng)壁超聲心動圖檢測，B型超聲記錄心臟運動情況，M型超聲測量同一個心動周期內(nèi)左室收縮末期和舒張末期的左室內(nèi)徑，系統(tǒng)計算左室收縮末期容積(LV-s)，左室舒張末期容積(LV-d)，左室相對質(zhì)量(LV-mass)，左室射血分數(shù)(EF％)，左室短軸縮短率(FS％)，血流E峰、A峰比值(E/A)。
　　 5.血清學指標檢測
　　 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中心肌損傷相關(guān)指標Tn-T、BNP的含量

29、，反應心肌損傷程度。
　　 6.外周血、骨髓中內(nèi)皮祖細胞量的測定
　　 外周血/骨髓細胞懸液經(jīng)紅細胞裂解后與CD34、CD133、VEFFR2抗體共孵育，后再與之相對應的二抗:IgG-PerCP-Cy5.5、IgG-F(ab)2-PE、IgG-FITC共孵育。流式細胞儀分析細胞群中三種標志物陽性表達的細胞數(shù)。
　　 7.體外培養(yǎng)的骨髓內(nèi)皮祖細胞功能測定
　　 (1)增殖功能檢測:MTT法檢測EPCs增殖能

30、力。
　　 (2)遷移功能檢測:Transwell小室法檢測EPCs遷移能力。
　　 (3)成管功能檢測:Matrigel膠輔助下的EPCs管腔結(jié)構(gòu)形成能力檢測。
　　 8.組織病理學染色
　　 留取大鼠心臟標本，行蘇木素-伊紅染色(HE)，POLEY缺血染色，觀察心肌組織形狀，及各組心肌缺血情況。
　　 9.心肌細胞凋亡情況檢測
　　 TUNEL法檢測各組梗死區(qū)及其周邊區(qū)心肌細胞的凋亡情

31、況
　　 10.免疫組織化學染色
　　 免疫組織化學檢測梗死部分心肌血管新生情況，檢測新生毛細血管內(nèi)皮相關(guān)豐旨標CD133、VEGFR2。
　　 11.實時定量聚合酶鏈反應(Real-timePCR)檢測組織mRNA水平(
　　 )Real-timePCR檢測心肌組織內(nèi)血管新生相關(guān)指標CD133、VEGFR2的表達水平。
　　 12.統(tǒng)計學分析
　　 統(tǒng)計學處理數(shù)量資料以均數(shù)±標準差（(x

32、)±s）表示，所有數(shù)據(jù)用軟件SPSS11.5進行統(tǒng)計分析。兩組數(shù)據(jù)間比較用獨立樣本的t檢驗，多組之間的兩兩比較用單因素方差分析。多組間的兩兩比較用費希爾的LSD法。當P＜0.05，認為有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.實驗動物的一般情況
　　 本研究共涉及雄性WISTAR大鼠120只，假手術(shù)32只，心梗手術(shù)56只。行心梗手術(shù)的大鼠當天死亡5只，手術(shù)成功率為91％，心梗急性期3天內(nèi)死亡4只，急性期存活率為84

33、％，其后的試驗中死于超聲麻醉意外的2只，不明原因死亡2只，總存活率為77％。假手術(shù)組術(shù)后急性期死亡2只，存活率為94％。
　　 2.心電圖及心臟超聲檢測結(jié)果
　　 大鼠于術(shù)前和術(shù)中進行心電圖監(jiān)測，顯示結(jié)扎后ST段改變和病理性Q波的出現(xiàn)。大鼠術(shù)后超聲結(jié)果與術(shù)前相比較:左室收縮期內(nèi)徑(LV-s)、左室舒張期內(nèi)徑(LV-d)、左室相對質(zhì)量(LV-mass)升高，左室射血分數(shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)下降，E/A倒置(P＜

34、0.01～0.05)。這些指標的變化標志著心梗模型的成功建立。
　　 超聲結(jié)果顯示:在大鼠心梗急性期（術(shù)后3天至術(shù)后1周），熟地組和生理鹽水組大鼠的左室射血分數(shù)幾乎沒有差異;而在心梗的慢性期（術(shù)后2周至術(shù)后4周），與生理鹽水組相比熟地組可明顯改善心梗造成的EF、FS的降低(P＜0.05)。
　　 3.血清學檢測
　　 心梗術(shù)后血清中Tn-T和BNP含量與對照組和假手術(shù)組相比顯著升高(P＜0.01)亦證實了心梗模型

35、的成功建立。
　　 心梗后，熟地組血清Tn-T含量在術(shù)后1周末開始下降(P＜0.01～0.05)，而生理鹽水組則在術(shù)后4周末開始下降(P＜0.05)，證實熟地可在心梗后降低心肌損傷。
　　 心梗后，生理鹽水組血清中的BNP含量隨著時間延長呈上升趨勢(P＜0.01～0.05)，而在熟地組這種上升趨勢則不明顯。提示熟地干預可降低心梗后發(fā)生心肌細胞相關(guān)延時性損傷的風險。
　　 4.外周血和骨髓中EPCs含量的測定

36、>　　 心梗術(shù)后與術(shù)前相比，熟地組和生理鹽水外周血的EPCs含量均升高而骨髓中EPCs含量則降低(P＜0.01～0.05)，說明心梗發(fā)生后，心肌損傷導致骨髓中的EPCs被動員到了外周血中。在心肌梗死發(fā)生后的慢性期（2周末和4周末），熟地組外周血EPCs的增長幅度大于生理鹽水組(P＜0.01)，而熟地組骨髓EPCs的降低不如生理鹽水組明顯(P＜0.01)，可見熟地可以增加動員到外周血的EPCs數(shù)量同時保持骨髓中EPCs的儲備量。由此亦可

37、判斷，熟地作用于心梗大鼠，除了增加了EPCs動員量以外，體內(nèi)EPCs總量也有所增加。
　　 5.骨髓EPCs功能的測定
　　 (1)增殖功能檢測:心肌的梗死使生理鹽水組和熟地組的EPCs增殖能力均有所上升(P＜0.01)，這種上升在生理鹽水組于術(shù)后2周開始下降(P＜0.05)，而在熟地組這種增殖能力則一直保持在較高水平?？梢娛斓乜纱龠M心梗后EPCs的增值能力。
　　 (2)遷移功能檢測:心梗后生理鹽水組和熟地組的

38、EPCs遷移能力均有所增加(P＜0.01)，而在心梗術(shù)后4周，熟地組EPCs的遷移能力比生理鹽水組更加活躍(P＜0.05)。
　　 (3)成管功能檢測:從心梗術(shù)后2周熟地組EPCs參與成管的數(shù)量明顯多于生理鹽水組(P＜0.05)。在空白對照組，也有類似的情況發(fā)生。說明，熟地可強化心梗后EPCs的成管功能，亦能在生理狀態(tài)下激活這種功能。
　　 6.組織病理學染色檢測
　　 (1)HE染色顯示:術(shù)后1周開始，梗死心肌

39、組織發(fā)生明顯的組織形態(tài)學變化:梗死區(qū)肌纖維溶解、斷裂，排列紊亂。
　　 (2)POLEY缺血染色:缺血心肌染為紅色，而正常心肌組織為藍色。在心梗的急性期（術(shù)后3天到1周）熟地組和生理鹽水組差異不明顯;到心梗慢性期（術(shù)后2周到4周）熟地組缺血心肌的面積較之生理鹽水組下降明顯(P＜0.05)。
　　 7.心肌細胞凋亡檢測
　　 TUNEL染色法用于檢測心肌細胞凋亡情況。在心梗術(shù)后2周和4周，熟地組心肌細胞的凋亡量明顯

40、少于生理鹽水組。
　　 8.免疫組織化學檢測
　　 (1)心肌梗死后，在兩種干預（生理鹽水和熟地）下，VEGFR2在心肌組織中的表達均隨時間變化有所增加(P＜0.05～0.01)，而在心梗發(fā)生1周以后（熟地灌胃9周）開始，VEGFR2在熟地組中的表達逐漸高于在生理鹽水組中的表達(P＜0.05～0.01)。
　　 (2)心肌梗死后，在兩種干預（生理鹽水和熟地）下，CD133在心肌組織中的表達均隨時間變化有所增加(P

41、＜0.05～0.01)，而在心梗的慢性期(心梗術(shù)后2周到4周，CD133在熟地組中表達的增多明顯高于生理鹽水組(P＜0.01)。
　　 9.Real-timePCR檢測
　　 為了驗證免疫組織化學中對VEGFR2、CD133表達量變化的檢測，我們用Real-timePCR在mRNA水平驗證VEGFR2和CD133的表達量。結(jié)果顯示VEGFR2和CD133在mRNA水平的變化趨勢與免疫組織化學染色法中檢測到的它們在蛋白水平

42、的變化趨勢一致。
　　 結(jié)論:
　　 (1)熟地灌胃可降低心梗后心肌細胞的缺血壞死和凋亡，通過增加血管新生改善梗死心肌的血供，保護梗死后的心室功能，改善預后。
　　 (2)熟地灌胃可增加心肌梗死后骨髓動員到外周血的EPCs數(shù)量，并保持EPCs的較高活性，促進其參與管腔形成;于此同時，又可保持骨髓EPCs數(shù)量的相對穩(wěn)定。
　　 (3)與生理鹽水組相比，熟地的治療作用大多發(fā)生在心肌梗死的慢性恢復期，而非急性發(fā)