SDF-1-CXCR7在內(nèi)皮祖細胞參與血管生成中的作用研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在許多生理、病理的血管生成過程中發(fā)揮著重要的作用。EPCs從骨髓中動員、歸巢到血管新生部位,參與血管生成是一個受到微環(huán)境中多因素調(diào)節(jié)的級聯(lián)動態(tài)過程?；|(zhì)衍生因子(StromaDerived Factor1,SDF-1)在促進EPCs動員、歸巢和新生血管形成等環(huán)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。過去的研究一直認為CXCR4是SDF-1的唯一作用受體,并且是調(diào)節(jié)SDF-1介

2、導(dǎo)的生物學行為的唯一調(diào)節(jié)因子。然而,近年來研究發(fā)現(xiàn)SDF-1的作用受體除了CXCR4,還有另一新的作用受體CXCR7,并.RCXCR7與SDF-1的親和能力還高于CXCR4。CXCR7的發(fā)現(xiàn)讓研究者不得不重新審視SDF-1的作用機制。在血管生成過程中,CXCR7的作用尚不明確,尤其是在EPCs中的作用還未見報道?？疾霤XCR7在EPCs參與血管生成中作用的一個關(guān)鍵問題就是構(gòu)建一個合適的血管生成模型,而血管生成是血管細胞與微環(huán)境微流相互作

3、用的復(fù)雜動態(tài)過程,傳統(tǒng)的體外血管生成模型很難將這一復(fù)雜過程體外再現(xiàn),因此需要尋求新的研究手段。近年來隨著微流控技術(shù)的發(fā)展,為體外構(gòu)建一個模擬在體微環(huán)境的血管生成模型提供了可能。本研究以EPCs為研究對象,利用近年發(fā)展起來的微流控技術(shù)體外構(gòu)建血管生成模型并結(jié)合體外細胞行為學實驗研究CXCR7在SDF-1介導(dǎo)的EPCs參與血管生成過程中的作用,并初步探討其作用機制,以期為血管生成相關(guān)疾病的治療提供新的作用靶點。本文的主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如

4、下:
　　 ①采用密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離得到骨髓單個核細胞,并結(jié)合差時貼壁法,收集24h后未貼壁細胞,然后用添加有SingleQuots多種細胞因子的EBM-2內(nèi)皮特異性培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取EPCs。通過形態(tài)學觀察、細胞表面特異性抗原標記鑒定和攝取功能等多種方法對EPCs進行鑒定分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在EBM-2內(nèi)皮特異性培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后,出現(xiàn)類似于血島樣的細胞集落,集落中央的細胞呈圓形,周邊的細胞呈放射狀;采用EPCs表面

5、特異性抗原標記CD133和VEGFR2進行免疫熒光染色鑒定細胞的表型,結(jié)果80％以上的細胞都是CD133+/VEGFR2+細胞,并且這些細胞同時能夠攝取Ac-LDL和結(jié)合UEA-1。以上結(jié)果表明,密度梯度離心法結(jié)合差時貼壁的方法從骨髓中分離獲得的單個核細胞,然后經(jīng)EBM-2條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)可獲得較高純度的EPCs,為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　 ②通過RT-PCR,Western-blotting和流式細胞術(shù)法分別從RNA水平、

6、蛋白質(zhì)水平以及膜上表達情況分別考察了EPCs中CXCR7的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR7和CXCR4均高表達于EPCs中。通過抗體中和法和小分子拮抗劑分別將CXCR7和CXCR4進行封閉阻斷,體外考察CXCR7和CXCR4在SDF-1介導(dǎo)的EPCs粘附、增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成中所扮演的角色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4和CXCR7均在SDF-1調(diào)節(jié)EPCs粘附、跨內(nèi)皮遷移、增殖和管樣結(jié)構(gòu)形成起著重要作用,SDF-1調(diào)節(jié)EPCs的趨化遷移是通過CX

7、CR4作用的,而在調(diào)節(jié)EPCs在應(yīng)激條件下的存活是通過與CXCR7作用。
　　 ③建立一個與生理相關(guān)的體外血管生成模型是血管生成研究的基礎(chǔ)。本研究利用近年發(fā)展起來的微流控技術(shù)結(jié)合細胞培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建了一個三維的血管生成模型,該模型能實現(xiàn)以下幾個功能:
　　 √能模擬在體血液流動,提供流體剪應(yīng)力加載刺激；
　　 √能為細胞的生長提供一個3D生長環(huán)境,并且能在3D微環(huán)境中實現(xiàn)可溶性因子的梯度分布；
　　 √能評價

8、內(nèi)皮細胞的活力、增殖和自組織等行為；
　　 √可以實時動態(tài)跟蹤內(nèi)皮細胞的運動軌跡。
　　 通過考察促血管生長因子對內(nèi)皮細胞增殖、遷移和形成管樣結(jié)構(gòu)形成能力的影響來評價該系統(tǒng)用于體外血管生成模型研究的可行性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在促血管生長因子的誘導(dǎo)下,內(nèi)皮的增殖能力顯著提高并能形成復(fù)雜的管腔樣結(jié)構(gòu),同時也發(fā)現(xiàn)在促血管生長因子濃度梯度的誘導(dǎo)下,內(nèi)皮細胞高濃度的區(qū)域內(nèi)遷移,侵入3D基質(zhì)中內(nèi)皮細胞也組織成血管網(wǎng)絡(luò)。這些結(jié)果表明該系統(tǒng)可以為

9、體外的血管生成機理研究提供一個良好的研究平臺,同時也為血管藥物的初步篩選提供一個可靠的實驗平臺。
　　 ④利用基于微流控芯片的血管生成模型,考察CXCR7和CXCR4在SDF-1誘導(dǎo)EPCs摻入胞外基質(zhì)及在胞外基質(zhì)中形成血管樣結(jié)構(gòu)的作用,并初步探討其作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在SDF-1濃度梯度誘導(dǎo)下,當CXCR7或CXCR4其中任何一個受到拮抗劑抑制后,EPCs摻入基質(zhì)的能力都受到顯著的抑制,并且發(fā)現(xiàn)SDF-1誘導(dǎo)EPCs在3D基質(zhì)

10、膠中形成血管樣結(jié)構(gòu)也是通過與受體CXCR4和CXCR7共同作用實現(xiàn)的。進一步發(fā)現(xiàn),MMP的抑制劑GM6001明顯抑制SDF-1誘導(dǎo)EPCs摻入到細胞外基質(zhì)和形成血管樣結(jié)構(gòu),與CXCR7或CXCR4的小分子拮抗劑的效果相當,而我們實驗室的另一研究小組發(fā)現(xiàn)SDF-1能促進MMP2的分泌,但當加入CXCR4或CXCR7拮抗劑后,MMP2的分泌顯著下降。通過這些研究結(jié)果,我們推測,SDF-1誘導(dǎo)EPCs摻入胞外基質(zhì)和形成血管樣結(jié)構(gòu)的一個可能途徑

11、就是促進MMP的分泌,降解胞外基質(zhì),從而有利于EPCs的遷移,而SDF-1介導(dǎo)的MMP的分泌可能是通過與其兩個受體CXCR4,CXCR7聯(lián)合作用而實現(xiàn)的,并不是通過其中的某一個受體而發(fā)揮作用。
　　 綜合以上研究結(jié)果,我們推斷出如下結(jié)論:CXCR7和CXCR4在SDF-1介導(dǎo)EPCs參與血管生成的過程中發(fā)揮著不完全一致卻又缺一不可的作用:在調(diào)節(jié)EPCs粘附、摻入基質(zhì)、跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)移和形成血管樣結(jié)構(gòu)的過程中,CXCR7和CXCR4共同

12、參與調(diào)節(jié);而在EPCs趨化遷移過程中,SDF-1僅通過與受體CXCR4相互作用而發(fā)揮作用;SDF-1調(diào)節(jié)EPCs在應(yīng)激條件下的存活能力是通過受體CXCR7而不是CXCR4相互作用而實現(xiàn)的。這些結(jié)果表明CXCR7在EPCs歸巢和參與血管生成的過程中發(fā)揮著重要的作用,可能是血管生成相關(guān)疾病治療的又一新靶點。另外,本研究基于微流控技術(shù)構(gòu)建的血管生成模型不僅可以為細胞的生長提供一個近似于在體的生長環(huán)境,同時還能實時監(jiān)控細胞的行為響應(yīng),為血管生成