鋅離子對丙酮丁醇梭菌發(fā)酵的調(diào)控作用及機制.pdf

1、生物丁醇發(fā)酵工藝存在多方面限制因素，鋅(Zn2+)作為微生物生命代謝必需微量營養(yǎng)元素及關鍵輔因子同時受到廣泛關注，因而揭示Zn2+在丁醇生產(chǎn)菌株丙酮丁醇梭菌生理代謝的調(diào)控作用及機制對挖掘功能基因及建立菌株改造策略等具有重要的理論研究意義。本文研究工作通過生物過程工程策略、胞內(nèi)代謝水平分析、轉錄組學分析及基因工程改造策略等，系統(tǒng)闡釋鋅離子對丙酮丁醇梭菌丁醇發(fā)酵的多效調(diào)控作用及機制。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴外源添加ZnSO4·7H

2、2O對丙酮丁醇梭菌發(fā)酵具有多效調(diào)控作用，并確定鋅離子最適添加水平為1mg/L ZnSO4·7H2O，微量鋅離子一方面增強菌體對數(shù)生長、碳源利用、有機酸重吸收及溶劑代謝，丁醇產(chǎn)率由0.14g/L/h提高至0.32g/L/h;另一方面增強菌體對甲酸、乙酸、丁酸及丁醇的脅迫耐受性，有效緩解代謝遲滯，其中丁醇耐受水平由15g/L提高至18 g/L。同時，鋅離子與碳酸鈣對木糖代謝及丁醇耐受性存在協(xié)同調(diào)控。⑵對胞內(nèi)關鍵代謝物進行LC-ESI/MS分

3、析發(fā)現(xiàn)，鋅離子調(diào)控作用在代謝水平具有全局調(diào)控特性。在鋅離子響應狀態(tài)下，發(fā)酵前期胞內(nèi)糖酵解中間代謝產(chǎn)物G6P、F6P、FBP與PEP以及產(chǎn)酸/產(chǎn)溶劑代謝節(jié)點產(chǎn)物AcCoA、AcAcCoA與BuCoA含量降低，中心碳代謝轉化加快;能量ATP及還原力NADH含量水平提升，促使乙醇/丁醇代謝通路提前開啟以維持胞內(nèi)氧化還原平衡，進而調(diào)節(jié)中心碳流在關鍵代謝節(jié)點重分配。 全局轉錄組學分析表明鋅離子對胞內(nèi)中心碳代謝、能量代謝及氧化還原平衡等關鍵基因同樣

4、具有全局調(diào)控特性。在鋅離子響應狀態(tài)下，多種碳源（二糖、己糖及戊糖）轉運與代謝關鍵基因如葡萄糖轉運基因CAC0570(glcG，12.25倍)、CAC1353與CAC1354、果糖操縱子fru及木糖/阿拉伯糖轉運與代謝等相關14個基因轉錄水平顯著上調(diào)，糖酵解及產(chǎn)酸/產(chǎn)溶劑代謝相關13個基因轉錄水平也不同程度上調(diào)，但產(chǎn)氫代謝關鍵基因hydA、轉錄調(diào)控基因abrB，ctsR與hrcA以及脅迫應答基因轉錄水平下調(diào)。⑷基于葡萄糖轉運調(diào)控策略，在丙

5、酮丁醇梭菌中分別過表達glcG、CAC1353及CAC1354，在基因水平驗證鋅離子調(diào)控機制。過表達CAC1353或CAC1354重組菌株生長代謝出現(xiàn)遲滯;過表達glcG重組菌株ABE發(fā)酵性能顯著提高，發(fā)酵周期縮短至28h，丁醇產(chǎn)量及產(chǎn)率最高可達13.9 g/L及0.50 g/L/h，且甲酸、乙酸、丁酸及丁醇脅迫耐受性增強，其中在7.5 g/L乙酸脅迫條件下，丁醇產(chǎn)量可達16.4 g/L。LC-ESI/MS分析表明過表達glcG同樣具有