鋅離子對(duì)丙酮丁醇梭菌發(fā)酵的調(diào)控作用及機(jī)制.pdf

1、生物丁醇發(fā)酵工藝存在多方面限制因素，鋅(Zn2+)作為微生物生命代謝必需微量營(yíng)養(yǎng)元素及關(guān)鍵輔因子同時(shí)受到廣泛關(guān)注，因而揭示Zn2+在丁醇生產(chǎn)菌株丙酮丁醇梭菌生理代謝的調(diào)控作用及機(jī)制對(duì)挖掘功能基因及建立菌株改造策略等具有重要的理論研究意義。本文研究工作通過(guò)生物過(guò)程工程策略、胞內(nèi)代謝水平分析、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及基因工程改造策略等，系統(tǒng)闡釋鋅離子對(duì)丙酮丁醇梭菌丁醇發(fā)酵的多效調(diào)控作用及機(jī)制。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴外源添加ZnSO4·7H

2、2O對(duì)丙酮丁醇梭菌發(fā)酵具有多效調(diào)控作用，并確定鋅離子最適添加水平為1mg/L ZnSO4·7H2O，微量鋅離子一方面增強(qiáng)菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、碳源利用、有機(jī)酸重吸收及溶劑代謝，丁醇產(chǎn)率由0.14g/L/h提高至0.32g/L/h;另一方面增強(qiáng)菌體對(duì)甲酸、乙酸、丁酸及丁醇的脅迫耐受性，有效緩解代謝遲滯，其中丁醇耐受水平由15g/L提高至18 g/L。同時(shí)，鋅離子與碳酸鈣對(duì)木糖代謝及丁醇耐受性存在協(xié)同調(diào)控。⑵對(duì)胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物進(jìn)行LC-ESI/MS分

3、析發(fā)現(xiàn)，鋅離子調(diào)控作用在代謝水平具有全局調(diào)控特性。在鋅離子響應(yīng)狀態(tài)下，發(fā)酵前期胞內(nèi)糖酵解中間代謝產(chǎn)物G6P、F6P、FBP與PEP以及產(chǎn)酸/產(chǎn)溶劑代謝節(jié)點(diǎn)產(chǎn)物AcCoA、AcAcCoA與BuCoA含量降低，中心碳代謝轉(zhuǎn)化加快;能量ATP及還原力NADH含量水平提升，促使乙醇/丁醇代謝通路提前開(kāi)啟以維持胞內(nèi)氧化還原平衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)中心碳流在關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)重分配。 全局轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明鋅離子對(duì)胞內(nèi)中心碳代謝、能量代謝及氧化還原平衡等關(guān)鍵基因同樣

4、具有全局調(diào)控特性。在鋅離子響應(yīng)狀態(tài)下，多種碳源（二糖、己糖及戊糖）轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝關(guān)鍵基因如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因CAC0570(glcG，12.25倍)、CAC1353與CAC1354、果糖操縱子fru及木糖/阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝等相關(guān)14個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，糖酵解及產(chǎn)酸/產(chǎn)溶劑代謝相關(guān)13個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平也不同程度上調(diào)，但產(chǎn)氫代謝關(guān)鍵基因hydA、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因abrB，ctsR與hrcA以及脅迫應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。⑷基于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控策略，在丙

5、酮丁醇梭菌中分別過(guò)表達(dá)glcG、CAC1353及CAC1354，在基因水平驗(yàn)證鋅離子調(diào)控機(jī)制。過(guò)表達(dá)CAC1353或CAC1354重組菌株生長(zhǎng)代謝出現(xiàn)遲滯;過(guò)表達(dá)glcG重組菌株ABE發(fā)酵性能顯著提高，發(fā)酵周期縮短至28h，丁醇產(chǎn)量及產(chǎn)率最高可達(dá)13.9 g/L及0.50 g/L/h，且甲酸、乙酸、丁酸及丁醇脅迫耐受性增強(qiáng)，其中在7.5 g/L乙酸脅迫條件下，丁醇產(chǎn)量可達(dá)16.4 g/L。LC-ESI/MS分析表明過(guò)表達(dá)glcG同樣具有