丙酮丁醇梭菌輔因子代謝擾動研究.pdf

1、丙酮丁醇梭菌ABE((A)cetone-(B)utanol-(E)thanol)發(fā)酵從其開始到現(xiàn)在已經(jīng)有100多年的歷史，是曾經(jīng)僅次于酵母乙醇發(fā)酵的第二大發(fā)酵產(chǎn)業(yè)。但ABE發(fā)酵的發(fā)展經(jīng)歷諸多波折，最主要的原因就是受制于石油價格的波動。當石油價格下跌，ABE發(fā)酵就失去與石油基化學品的市場競爭力。因此提高ABE發(fā)酵本身的競爭力是擺脫石油價格困擾，實現(xiàn)自身可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。代謝工程改造是一種有效地改變細胞生理代謝特性的手段，其中輔因子作為

2、影響生理代謝的重要因素，在細胞代謝中發(fā)揮重要作用。
　　 本論文從對丙酮丁醇梭菌的輔因子代謝進行擾動入手，研究輔因子代謝對ABE發(fā)酵的影響，主要包括:
　　 (1)引入能量代謝擾動，縮短發(fā)酵周期，提高溶劑產(chǎn)率。本研究通過過量表達丙酮丁醇梭菌自身的具有水解ATP功能的F1-ATPase，降低細胞能荷水平，導致細胞生長加快，糖代謝增強，ATP周轉(zhuǎn)速率增加，增加NADH供給，使得發(fā)酵周期縮短約10h，溶劑的產(chǎn)量、得率和產(chǎn)率分別

3、提高15％、4.2％、76％。另一方面，代謝流分析顯示產(chǎn)酸期向產(chǎn)醇期的轉(zhuǎn)變提前，說明降低細胞能荷水平是一種可以觸發(fā)丙酮丁醇梭菌產(chǎn)酸到產(chǎn)醇轉(zhuǎn)變的信號。這是對丙酮丁醇梭菌生理代謝特性的新認識。
　　 (2)引入還原力代謝擾動，將經(jīng)典的ABE發(fā)酵改造為價值更高的IBE發(fā)酵。在ABE發(fā)酵中主要有三種產(chǎn)物:丙酮(Acetone)、丁醇(Butanol)和乙醇(Ethanol)。本研究在丙酮丁醇梭菌中引入一個消耗還原力的次級醇脫氫酶，將丙酮

4、完全轉(zhuǎn)化為了價值更高的異丙醇，一步法實現(xiàn)了經(jīng)典ABE發(fā)酵向IBE發(fā)酵的完全轉(zhuǎn)變。重組菌株48 h批式發(fā)酵可以產(chǎn)生約24 g/l的混合醇，其中包括15 g/l丁醇、7.6 g/l異丙醇和1.28 g/l乙醇，總醇對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達到31.4％。研究進一步揭示雖然引入還原力擾動，但從丙酮酸到丁酰輔酶A的消耗還原力的途徑具有很強的魯棒性，其代謝速率沒有明顯變化，而從?；o酶A到醇的消耗還原力的途徑受到影響，丁醇和乙醇生產(chǎn)途徑(retoh、rb

5、uoh)的反應速率下降，這說明該途徑的醛/醇脫氫酶受還原力的擾動作用更大。
　　 (3)進一步解析丙酮丁醇梭菌醛/醇脫氫酶失活后造成的還原力擾動對產(chǎn)醇的影響，提高丁醇選擇性。丙酮丁醇梭菌有多個依賴NADH的醛/醇醇脫氫酶（AdhE1、AdhE2、BdhA、BdhB、Cac3392、Cap0059），它們具有不同底物特異性，胞內(nèi)還原力在其之間的分配利用影響丁醇在溶劑中的比例。丁醇作為ABE發(fā)酵中價格最高的產(chǎn)物，提高其在總?cè)軇┲斜壤?/p>

6、是提高ABE發(fā)酵經(jīng)濟性的另一個重要途徑。本研究通過二型內(nèi)含子敲除技術(shù)對這些醇脫氫酶進行了失活，發(fā)酵評價了這些基因?qū)τ谏a(chǎn)丁醇乙醇的影響，研究發(fā)現(xiàn)adhe1和bdhB基因?qū)τ诒〈妓缶a(chǎn)醇至關(guān)重要，這兩個基因失活后，突變體菌株產(chǎn)醇能力下降，其中adhe1基因突變體菌幾乎喪失產(chǎn)醇能力。adhe2基因失活后，突變體菌株產(chǎn)醇能力增加，丁醇的產(chǎn)量可以達到16.3 g/l，增加12.5％，乙醇產(chǎn)量達到2.0 g/l，降低7％。丁醇乙醇比例由野生型

7、的6.65∶1提高到8.15∶1。bdhA基因失活后，突變體菌株丁醇產(chǎn)量沒有明顯變化，而乙醇產(chǎn)量提高42.3％，丁醇乙醇比例下降到5.6∶1。cac3392基因失活突變體菌株丁醇產(chǎn)量相比野生型菌株沒有明顯變化，但乙醇產(chǎn)量下降32.6％，丁醇乙醇比例提高到10.2∶1。cap0059基因插入失活突變體丁醇產(chǎn)量提高7.7％，達到15.4g/l，乙醇產(chǎn)量為1.45g/l，降低32.6％，丁醇乙醇比例提高到10.6∶1。這一工作為進一步改造丁醇

8、代謝流，提高丁醇選擇性，實現(xiàn)丙酮丁醇梭菌同型丁醇發(fā)酵提供了基礎(chǔ)。
　　 本論文通過輔因子工程對丙酮丁醇梭菌的能量代謝和還原力代謝進行擾動，縮短丙酮丁醇梭菌的發(fā)酵周期，提升生產(chǎn)效率;一步法實現(xiàn)ABE發(fā)酵價值更高的IBE發(fā)酵的轉(zhuǎn)變;解析醛/醇脫氫酶失活造成的還原力擾動對產(chǎn)醇的影響，為進一步提高丁醇選擇性打下了基礎(chǔ)。這些工作從輔因子代謝擾動的角度提高了丙酮丁醇梭菌ABE發(fā)酵的性能，為提高ABE發(fā)酵的市場競爭力，促進ABE發(fā)酵穩(wěn)定發(fā)展提