丙酮丁醇梭菌ldhL基因的克隆及在大腸桿菌中的表達和產(chǎn)乳酸發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、隨著聚乳酸應(yīng)用越來越廣泛，聚乳酸產(chǎn)業(yè)也得到了高速發(fā)展，而L-乳酸是聚乳酸合成的前體，也引起人們的高度重視，而工業(yè)化生產(chǎn)L-酸主要是通過微生物發(fā)酵法，但微生物發(fā)酵法的不足之處最主要就是L-乳酸的分離純化，因為在L-乳酸發(fā)酵過程中往往伴隨著D-乳酸或混合乳酸的產(chǎn)生，對L-乳酸下游的分離純化造成了很大的困難。如果通過基因工程的手段，構(gòu)建一株只產(chǎn)生L-乳酸的基因工程菌，這些問題便會迎刃而解，本實驗利用基因工程手段對基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)高純度的L-乳

2、酸途徑進行了成功探索。
　　 本課題從丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)中克隆到L-乳酸脫氫酶基因，簡稱ldhL，連接到表達載體pSE380上，命名為pSE3801dhL,并將其轉(zhuǎn)化到丙酮酸裂解酶基因和D-乳酸脫氫酶基因缺陷的Escherichia coli FMJ144中進行表達，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表達產(chǎn)物的分子量大小約為34KD，對菌體進行超聲破胞處理測其粗酶液中L-乳酸

3、脫氫酶的酶活力為42.4U/ml，該酶的最適pH值是6.4，最適反應(yīng)溫度是25℃。初步搖瓶發(fā)酵后用高效液相色譜檢測分析L-乳酸產(chǎn)量約為2.4g/L，產(chǎn)物中不含D-乳酸，不需要再進行手性分離。
　　 運用單因素實驗對大腸桿菌產(chǎn)L-乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了初步優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵條件為2.5％蛋白胨、2％酵母粉、2.5％氯化鈉、4％葡萄糖、5mmol/L IPTG、pH值為8.0、0.1％接種量、誘導(dǎo)溫度為30℃、0.3％硫酸鎂，優(yōu)