lux標記的汞特異生物傳感器構(gòu)建及其在污染土壤檢測中的應(yīng)用.pdf

1、本研究目的是構(gòu)建細菌熒光素酶基因(lux)標記的汞特異生物傳感器并對其在汞污染土壤中檢測應(yīng)用的可行性進行探討。本研究內(nèi)容主要包括：兩株lux標記工程菌的構(gòu)建以及發(fā)光性能的比較分析、改造Pseudomonas putida X4菌株的內(nèi)生質(zhì)粒構(gòu)建汞響應(yīng)的發(fā)光標記菌株以及組成型發(fā)光的對照菌株、X4發(fā)光標記菌株在汞污染土壤檢測中的應(yīng)用等三個方面。結(jié)果如下：
　　 1．分別以P. putida X4，Enterobacter aerog

2、enes NTG-01為宿主菌，構(gòu)建含有mer R-lux CDABE標記的重組質(zhì)粒，并通過氯化鈣法將質(zhì)粒導(dǎo)入到已消除質(zhì)粒的X4和NTG-01宿主菌株中，構(gòu)建兩株汞特異生物傳感器，并對其發(fā)光性能進行比較研究。結(jié)果表明：NTG-01發(fā)光標記菌株的最佳誘導(dǎo)時期是對數(shù)生長末期，而X4發(fā)光標記菌株的最佳誘導(dǎo)時期是對數(shù)生長中期；兩發(fā)光標記菌株的最短誘導(dǎo)時間是30 min，隨著誘導(dǎo)時間的延長發(fā)光強度增大，X4標記菌株在誘導(dǎo)4h時達到最大光強，而NT

3、G-01在Sh達到最大光強；在28℃、pH7、起始細胞數(shù)量為106CFU/mL時，兩傳感器對汞的最低檢測限為100 pmol/L;其他重金屬離子(Cd2+，Zn2+，C02+，Cu2+，Pb2+)在nanomolar水平不會干擾實驗的測定。
　　 2．以luxABCDE為報告基因，改造X4菌株的內(nèi)生質(zhì)粒pX4，形成lux標記的重組質(zhì)粒pUC-luxABCDE-merR-Kan-X4以及pUC-luxABCDE-Kan-X4，并通

4、過電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到已經(jīng)消除質(zhì)粒的宿主菌X4中，構(gòu)建lux標記的特異性汞響應(yīng)發(fā)光菌株以及組成型發(fā)光的對照菌株。通過比較對照菌株在不同汞濃度下發(fā)光強度的變化，研究了汞對微生物細胞的毒害以及誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明：低于1μmol/L汞對微生物細胞基本沒有毒害作用，主要是誘導(dǎo)作用；1～10μmol/L汞對細胞既有毒害作用又有誘導(dǎo)作用，發(fā)光值急劇下降；高于20μmol/L汞對細胞主要是毒害作用；100μmol/L時，發(fā)光值降到零，很顯然是由于汞

5、的毒性效應(yīng)所致。
　　 3．以X4(pUC-luxABCDE-merR-Kan-X4)為研究對象，對該工程菌在農(nóng)田土壤的定殖存活能力以及對汞污染土壤檢測的可行性進行探討。結(jié)果表明：該工程菌株在滅菌土壤和天然土壤中的存活趨勢基本相同，在30 d后仍可保持在104 CFU/g土壤；四個不同汞污染程度的土壤，利用生物傳感器檢測的土壤水抽提液汞的濃度均稍低于化學(xué)檢測方法。研究結(jié)果顯示：生物傳感器方法與化學(xué)方法有效結(jié)合可以對污染土壤生物可