梯度稀釋補料酶膜耦合反應(yīng)制備牛奶蛋白ACE抑制肽的研究.pdf

1、為了研究和探索一種制備牛奶蛋白ACE抑制肽的最佳酶膜耦合工藝模型，本文在傳統(tǒng)酶解和不補料酶膜耦合最優(yōu)工藝基礎(chǔ)上，對比性探究了等濃度補料、先補料后補水和梯度稀釋補料三種酶膜耦合反應(yīng)過程的穩(wěn)定性及酶解效果，并對梯度稀釋補料酶膜耦合的酶解動力學(xué)及穩(wěn)定運行試驗進行了探究。具體研究內(nèi)容如下：
　　以脫脂奶粉為原料，對5種蛋白酶進行篩選，以ACE抑制率和IC50為考察指標(biāo)，確定中性蛋白酶為本試驗用酶。利用單因素試驗、正交試驗優(yōu)化酶解條件，得出

2、最優(yōu)反應(yīng)條件為：反應(yīng)時間60 min、底物濃度11％、加酶量2000 U/g、溫度50℃、pH7.0。
　　以膜通量、ACE抑制率和IC50為指標(biāo)，確定超濾膜分子量為5 kDa。通過不補料酶膜耦合單因素試驗，得到酶膜耦合反應(yīng)最優(yōu)工藝為：底物濃度7%、加酶量2000 U/g、反應(yīng)時間100 min、循環(huán)泵轉(zhuǎn)速100 r/min，在該條件下蛋白轉(zhuǎn)化率為53.16%、ACE抑制率為76.81%，單位酶產(chǎn)肽量為39.59 g肽·(g酶)-

3、1。與對照比較，蛋白轉(zhuǎn)化率、ACE抑制率、單位酶產(chǎn)肽量分別提高16.99%、18.55%、16.61%。采用高效凝膠過濾色譜法測定超濾液中ACE抑制肽的分子量分布，3 kDa以下組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.60%。
　　繪制三種補料模式下的酶膜耦合反應(yīng)進程曲線，結(jié)果表明，等濃度補料穩(wěn)定性最差，先補料后補水穩(wěn)定性較差，梯度稀釋補料反應(yīng)最為穩(wěn)定。梯度稀釋補料反應(yīng)體系具有透過液濃度高（12.748 mg/mL）、膜通量變化幅度最?。?20.40

4、3 mL·(m2·min)-1左右）、反應(yīng)器內(nèi)蛋白濃度相對穩(wěn)定（22.637 mg/mL）等優(yōu)點。對比三種補料模式酶解效果，梯度稀釋補料模式蛋白轉(zhuǎn)化率和多肽得率最高，分別是67.58%、67.07%；比先補料后補水模式分別提高12.35%、9.93%；比等濃度補料模式分別提高62.30%、34.03%。因此，梯度稀釋補料酶膜耦合反應(yīng)，穩(wěn)定性好，酶解效率高，是一種酶解蛋白制取活性多肽的有效手段。
　　在梯度稀釋補料酶膜耦合酶解過程中

5、，擬合水解度DH與底物濃度S0及水解時間t的關(guān)系，可據(jù)此預(yù)測其他S0下DH隨時間的變化情況?；趯γ附鈾C制的合理假設(shè)，建立梯度稀釋補料酶膜耦合反應(yīng)過程動力學(xué)模型，得動力學(xué)常數(shù)Km=69.481 g/L，Vmax=0.752 g·l-1 min-1，對不同底物濃度下梯度稀釋補料酶膜耦合反應(yīng)過程進行模擬，實驗值與模擬值吻合較好。通過米氏常數(shù)確認(rèn)最優(yōu)底物濃度為70 g/L。
　　在動力學(xué)模型得出的最佳底物濃度下，梯度稀釋補料酶膜耦合反應(yīng)

6、可持續(xù)運行720 min，酶解結(jié)果如下：蛋白轉(zhuǎn)化率74.51%、多肽得率75.13%、單位酶產(chǎn)肽量142.27 g肽·(g酶)-1、IC500.77 mg/mL；粗肽產(chǎn)品灰分為8.04%、水分為11.68%、多肽含量為37.40%。
　　綜上所述，梯度稀釋補料酶膜耦合模型既克服了酶利用率低和反應(yīng)后期底物不足等問題，又吸取了多種酶膜耦合補料方式的優(yōu)點，可顯著提高酶利用率和生產(chǎn)效率，為工業(yè)化生產(chǎn)牛奶蛋白ACE抑制肽提供一種更為有效的方