酶法制備羊乳酪蛋白ACE抑制肽及分離純化.pdf

1、高血壓是由人體內(nèi)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(agioten sinconverting enzyme，ACE)活性過(guò)高所引起的一種常見(jiàn)的慢性疾病。ACE抑制肽是通過(guò)抑制ACE的活性，達(dá)到降低血壓的作用。研究表明，食源性ACE抑制肽，相對(duì)于傳統(tǒng)的降壓藥物，具有安全有效、無(wú)毒副作用的優(yōu)勢(shì)，成為研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)食源ACE抑制肽開(kāi)展了廣泛研究工作，日本已有降壓產(chǎn)品上市，而我國(guó)尚處于研究階段。陜西具有豐富的羊乳資源，但羊乳產(chǎn)品種類單一，主要

2、以羊奶粉為主，附加值低，因此開(kāi)發(fā)羊乳酪蛋白ACE抑制肽，對(duì)完善羊乳產(chǎn)業(yè)多樣性，提高附加值具有促進(jìn)作用。
　　本課題以羊乳為原料，利用等電點(diǎn)沉淀法制備酪蛋白，通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化工藝參數(shù);采用不同的蛋白酶對(duì)制備的酪蛋白進(jìn)行水解，以ACE抑制率和水解度（degree of hydrolysis，DH）為指標(biāo)，優(yōu)化酶解工藝;將上述最佳酶解條件下得到酪蛋白酶解物，分別通過(guò)超濾、大孔吸附樹(shù)脂、凝膠色譜等手段分離、純化ACE抑制肽，研

3、究表明:
　　以羊乳為原料、酪蛋白得率為指標(biāo)，溫度、pH、攪拌強(qiáng)度為控制參數(shù)，通過(guò)單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，采用等電點(diǎn)沉淀制備酪蛋白，確定的工藝參數(shù)為:溫度45℃、pH4.6、攪拌強(qiáng)度1200rpm，酪蛋白得率達(dá)到1.931g/100mL。
　　以ACE抑制率和水解度為指標(biāo)，分別采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase及蛋白酶K于最適條件下水解酪蛋白，結(jié)果表明，Alcalase為水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的最佳用

4、酶，Alcalase和胰蛋白酶為最佳復(fù)合水解酶。
　　對(duì)Alcalase水解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的過(guò)程進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到的最佳工藝條件為:溫度69℃、pH8.95、底物濃度10％、酶添加量5％及水解時(shí)間165min，在此條件下，酶解蛋白液的ACE抑制率為90.19％;Alcalase和胰蛋白酶復(fù)合水解羊乳酪蛋白的最佳酶解工藝條件:溫度69℃、pH8.4、底物濃度12％、復(fù)合酶比例為1∶1、酶添加量8.25％、水解時(shí)間90m

5、in，復(fù)合酶解蛋白液的ACE抑制率達(dá)到了91.99％。
　　采用Lineweaver-Burk法求得Alcalase單酶水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)為:Km為0.1519mg/mL，Vmax為0.1302mg/mL·min;Alcalase和胰蛋白復(fù)合酶水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)為Km為0.1274mg/mL，Vmax為0.1541mg/mL·min。比較單酶與復(fù)合酶水解效果發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶水解優(yōu)于單酶水解。
　　制備的酪蛋白酶解物經(jīng)截留分子量分別

6、為10kDa、5kDa、1kDa的超濾膜超濾分離，結(jié)果表明，超濾膜為1kDa的透過(guò)液，ACE抑制率最高，達(dá)到89.09％，IC50為0.2983mg/mL。
　　采用大孔吸附樹(shù)脂DA201-C處理1kDa透過(guò)液，調(diào)節(jié)上樣pH4.0，以75％乙醇為洗脫劑，純化后的ACE抑制率達(dá)到了90.12％，IC50為0.257mg/mL，較純化前均有所提高。
　　通過(guò)SephadexG-25純化上述組分，以蒸餾水為洗脫劑，上樣濃度150m

7、g/mL，洗脫劑流速0.8mL/min，在此條件下將酶解物分成三個(gè)組分G1、G2、G3，其中G2活性最高，ACE抑制率達(dá)到91.23％，IC50為0.175mg/mL。采用SephadexG-15再次純化分離組分G2得到G2-1、G2-2，其中G2-2活性最高，ACE抑制率達(dá)到92.16％，IC50為0.134mg/mL。
　　本課題制備的羊乳酪蛋白ACE抑制肽，具有較高的ACE抑制活性，可以作為添加劑，用于高血壓患者降壓食品的開(kāi)