復(fù)雜糖綴合物的合成及生物學(xué)功能評價(jià).pdf

1、糖廣泛分布在自然界中的各種生物體中，并且發(fā)揮許多重要功能;其在生物體主要以糖綴合物的形式存在，與蛋白質(zhì)、脂等物質(zhì)共價(jià)鍵相連，形成糖蛋白/蛋白聚糖、糖脂等綴合物。糖鏈中單糖糖基間糖苷鍵形成的位置、構(gòu)型的不同、以及糖鏈修飾方式的不同，賦予糖綴合物高度多樣性和異質(zhì)性;不同細(xì)胞、組織器官所具有的多樣的糖綴合物賦予各細(xì)胞、組織器官不同的表型及功能。
　　細(xì)菌細(xì)胞表面存在由諸多糖綴合物組成的糖萼，在細(xì)胞黏附及定植過程中發(fā)揮重要作用，并且能保護(hù)

2、細(xì)菌自身免受其他生物體的攻擊;值得關(guān)注的是，細(xì)菌表面糖組份具有抗原性，如存在于革蘭氏陰性菌表面的脂多糖，可介導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。據(jù)此，細(xì)菌表面的多糖抗原成為致病菌疫苗研發(fā)的關(guān)注點(diǎn)。
　　脂多糖，存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞表面，由脂質(zhì)A、核心寡糖及O-多糖組成;O-多糖（O-polysaccharide，O-PS），亦稱之為O-抗原，脂多糖的最外層結(jié)構(gòu)，是機(jī)體免疫系統(tǒng)識別的重要靶點(diǎn);O-抗原是細(xì)菌多糖疫苗研發(fā)的主要依據(jù);同時(shí)，O-抗

3、原具有較高的變異性，不同的菌種其O-抗原結(jié)構(gòu)不同，因此，據(jù)此研發(fā)的多糖疫苗廣譜性差。
　　核心寡糖，連接O-抗原與脂質(zhì)A，其糖鏈結(jié)構(gòu)與O-多糖相比，在菌種之間相對保守，并具有一定的抗原性，可作為廣譜性多糖疫苗研發(fā)的候選成分。根據(jù)糖鏈結(jié)構(gòu)的不同，E.coli的核心寡糖分為四種類型:R1、R2、R3及K12，其中R3結(jié)構(gòu)存在于多種腸出血性大腸桿菌。值得注意的是，糖抗原疫苗所觸發(fā)宿主的免疫反應(yīng)是不依賴于T細(xì)胞的，幾乎不產(chǎn)生IgG抗體以及

4、無免疫記憶，免疫活性的持續(xù)性差，需提高糖抗原疫苗的免疫原性。
　　細(xì)菌表面多糖除具有抗原性以外，也有其他活性表現(xiàn)，例如，研究證實(shí)的大腸桿菌O86∶B7的O-抗原結(jié)構(gòu)與人類血型抗原B抗原結(jié)構(gòu)相似，具有B抗原活性。
　　ABO血型系統(tǒng)是人類最重要的血型系統(tǒng)。當(dāng)血型抗原A/B輸入帶有相對應(yīng)血型抗體抗A/抗B人體內(nèi)時(shí)，血型抗原與相應(yīng)血型抗體結(jié)合，即出現(xiàn)ABO血型不兼容(ABO-incompatible，ABOi)，可導(dǎo)致紅細(xì)胞聚集和

5、破裂，甚至死亡;去除血漿中抗A或B抗體可降低ABOi導(dǎo)致的超急性排斥反應(yīng)和移植物壞死。目前，去除血型抗體常用的方法是用A/B血型抗原作為免疫吸附劑，特異性的吸附去除血型抗體。然而，血型A/B抗原的獲得方式有限，并且難固定化，這成為免疫吸附法應(yīng)用的瓶頸。
　　A/B抗原主要通過化學(xué)方法合成或酶法合成獲得?；瘜W(xué)合成步驟繁多，形成特定立體構(gòu)型糖苷鍵是難點(diǎn);酶法合成，主要利用相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶催化A/B抗原合成，但糖基轉(zhuǎn)移酶來源有限，并且參

6、與反應(yīng)的活化的糖基供體價(jià)格昂貴，這些因素均限制了該方法的實(shí)際應(yīng)用。因此，亟需找到一種高效、低廉的獲得A/B抗原的途徑。大腸桿菌O86∶B7可成為合成B抗原的細(xì)胞工廠。
　　本論文的研究內(nèi)容分為兩部分。第一部分是大腸桿菌核心寡糖綴合物的合成及免疫學(xué)評價(jià)（第二章）;第二部分是MBPmut-OPS的合成及其吸附血型抗B抗體的應(yīng)用（第三章）。
　　第一部分:
　　本章首先分析E.coli胞外脂多糖結(jié)構(gòu)，尤其是核心寡糖R3的外核

7、結(jié)構(gòu)，R3的外核寡糖由五個(gè)單糖糖基組成，并具有分支結(jié)構(gòu)，據(jù)此設(shè)計(jì)合理的化學(xué)反應(yīng)方案，化學(xué)方法合成了R3外核寡糖的全五糖pentasaccharide結(jié)構(gòu);為提高多糖抗原的免疫原性，在糖鏈還原端添加丙基氨基連接器;通過活化的連接器將pentasaccharide與載體蛋白共價(jià)連接，合成了Pentasaccharide-CRM197(Penta-CRM197)以及Pentasaccharide-BSA（Penta-BSA）兩種糖綴合物;然后

8、對這兩種糖綴合物進(jìn)行了定性定量分析。
　　為明確Pentasaccharide-CRM197的免疫活性，利用小鼠進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。Pentasaccharide-CRM197為免疫抗原免疫小鼠，檢測并分析其對小鼠的免疫活性。ELISA實(shí)驗(yàn)檢測免疫小鼠血清抗pentasaccharide抗體滴度，結(jié)果顯示，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高滴度的特異性的抗pentasaccharide寡糖的抗體，包括IgG和IgM，這提示Penta-CRM197可很好

9、的刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，這也是評價(jià)疫苗免疫效果的重要指標(biāo)之一。
　　為進(jìn)一步明確Penta-CRM197在小鼠體內(nèi)所激活的Th細(xì)胞的類型，分析了Penta-CRM197免疫小鼠所產(chǎn)生抗體IgG的亞型。小鼠體內(nèi)IgG亞型有IgG1、IgG2、IgG3等。IgG亞型各有不同的功能和特點(diǎn)（見表1.5），IgG亞型的不同可反應(yīng)Th免疫應(yīng)答的類型的不同(Th1型或Th2型)。在本實(shí)驗(yàn)中，Penta-CRM197可同時(shí)刺激Th1及Th2細(xì)

10、胞應(yīng)答，其中以Th2應(yīng)答為主。
　　為驗(yàn)證Penta-CRM197激活的免疫系統(tǒng)是否具有殺傷R3型致病菌的能力，本實(shí)驗(yàn)選取含有R3結(jié)構(gòu)的致病菌E.coli O157∶H7作為對抗菌，進(jìn)行了體外殺菌實(shí)驗(yàn);結(jié)果顯示，Penta-CRM197免疫血清對E.coli O157∶H7具有殺傷作用，免疫血清在稀釋倍數(shù)≤160時(shí)，即可達(dá)到50％的殺傷率。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成了一種新的糖綴合物，并可以在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生有效的免疫活性

11、。本章內(nèi)容為細(xì)菌多糖綴合物疫苗的設(shè)計(jì)及合成提供新的思路，也提示本實(shí)驗(yàn)合成的Penta-CRM197作為抗E.coli R3致病菌的疫苗的潛能。
　　第二部分:
　　細(xì)菌胞外多糖除上述的抗原活性，尚具有其他生物學(xué)活性;值得一提的是大腸桿菌O86∶B7的O-抗原，其結(jié)構(gòu)與人類血型抗原B抗原結(jié)構(gòu)相似，具有B抗原活性。鑒于目前B抗原獲取的困難以及制備通用血型的迫切性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)想將大腸桿菌O86∶B7作為B抗原的細(xì)胞工廠，合成具有B0

12、抗原活性的O-抗原，并將其綴合在載體蛋白上，以便于分離純化。
　　本部分中，大腸桿菌O86∶B7作為O-抗原合成的工廠，然而大腸桿菌O86∶B7不具有相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶，不能將O-抗原綴合在特定蛋白上。為此，我們將空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni）N-糖基化系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌O86∶B7細(xì)胞內(nèi)，該系統(tǒng)的糖基轉(zhuǎn)移酶PglB是合成糖蛋白綴合物的關(guān)鍵;PglB催化糖鏈從萜醇類脂載體轉(zhuǎn)移并連接在載體蛋白的

13、天冬酰胺(N)殘基上，該天冬酰胺殘基須位于特定的氨基酸序列D/E-X-N-Y-S/T(X，Y≠P)中;在PglB的作用下，可將大腸桿菌O86的O-抗原糖鏈連接于特定的載體蛋白上。
　　本實(shí)驗(yàn)選取麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltose-binding protein，MBP)為O-抗原的載體蛋白，MBP由malE基因編碼，參與麥芽糖/麥芽糖糊精的轉(zhuǎn)運(yùn)，與麥芽糖/麥芽糖糊精具有高親和力;在MBP肽鏈的N末端存在有引導(dǎo)其進(jìn)入E.coli周質(zhì)空間

14、的信號肽，因此，MBP經(jīng)常作為E.coli蛋白表達(dá)系統(tǒng)的融合標(biāo)簽，阻止蛋白包涵體的形成。
　　在構(gòu)建E.coli N-糖基化系統(tǒng)時(shí)，向E.coli導(dǎo)入的以上兩種基因:Cjejuni糖基轉(zhuǎn)移酶PglB的基因、MBP編碼基因malE，分別使用的載體質(zhì)粒是pACT3、pBAD24。由于MBP的氨基酸序列不存在PglB所需要的糖基化位點(diǎn)，因此對MBP基因malE的堿基序列進(jìn)行了改造，在其表達(dá)MBP蛋白C端插入D/E-X-N-Y-S/T(X

15、，Y≠P)糖基化序列，將改產(chǎn)物命名為MBPmut。這樣，PglB可以E.coli的O-抗原為糖供體，以MBPmut為蛋白供體，催化合成具有B抗原活性的MBPmut-O-抗原綴合物。
　　為使E.coli的O-抗原更有效的連接與載體蛋白上，本實(shí)驗(yàn)通過Red重組系統(tǒng)（包括3個(gè)質(zhì)粒: pKD4、pSIM19、pCP20），成功敲除了E.coli O86的waal基因，不能表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶Waal，導(dǎo)致E.coli O86不能將O-PS轉(zhuǎn)移

16、并連接在Lipid A-core的糖基上，使得O-PS在E.coli周質(zhì)空間中積累，更好的為N-糖基化系統(tǒng)提供糖鏈供體。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功建立了E.coli N-糖基化系統(tǒng)，將具有B抗原活性的O-抗原呈現(xiàn)于載體蛋白MBPmut上，成功表達(dá)了MBPmut-OPS。經(jīng)純化得到的糖綴合物，經(jīng)后續(xù)鑒定實(shí)驗(yàn)包括考馬斯亮藍(lán)染色檢測、Western blot檢測、MALDI-TOF檢測結(jié)果證實(shí)是MBPmut-OPS，定量檢測得出純度達(dá)9

17、5％、純化得率約為1.5 mg/L（蛋白定量）。
　　通過Western鑒定，純化得到的MBPmut-OPS具有人血型B抗原活性，并且，ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，MBPmut-OPS可特異性結(jié)合人抗B抗體，而沒有檢測到其與抗A抗體的相互作用;在此驗(yàn)證結(jié)果的基礎(chǔ)之上，將MBPmut-OPS與人的A血型及O血型血漿相互作用，對比作用前后血漿中抗B抗體滴度，結(jié)果顯示MBPmut-OPS能夠有效的吸附血漿中的抗B抗體;并且進(jìn)一步證實(shí)，該吸附作用