甲氨喋呤脂質(zhì)體的制備及抗腫瘤作用研究.pdf

1、脂質(zhì)體作為一種藥物遞送系統(tǒng)具有生物相容性好、可降解和無毒性的特點(diǎn)，對單核巨噬細(xì)胞有著天然的靶向性。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，來自于血液單核巨噬細(xì)胞，可通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。甲氨喋呤(methotrexate，MTX)作為一種常用抗癌藥物，有研究顯示其對單核巨噬細(xì)胞具有特異性毒性。本文將MTX包載入脂質(zhì)體中，制備了載MTX的傳統(tǒng)脂質(zhì)體和聚

2、乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)修飾長循環(huán)脂質(zhì)體，考察前者在體外對巨噬細(xì)胞的毒性作用，并初步考察了二者的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)差異，為進(jìn)一步研究其在TAMs含量高的小鼠3-甲基膽（3-methylcholanthrene，3-MCA）骨肉瘤和TAMs含量低的小鼠CT26結(jié)腸癌模型的抗瘤活性提供基礎(chǔ)，從而最終確定MTX脂質(zhì)體能否通過作用于TAMs而發(fā)揮抗腫瘤活性，反過來也能進(jìn)一步驗(yàn)證TAMs能否適于作為抗腫瘤的重要輔助靶點(diǎn)。<

3、br>　　具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1)MTX傳統(tǒng)脂質(zhì)體的制備及表征
　　采用薄膜分散法制備出了MTX傳統(tǒng)脂質(zhì)體，通過濁度和MTX吸附率的測定，確定了MTX脂質(zhì)體純化的工藝條件;通過動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)及掃描電子顯微鏡(SEM)對MTX脂質(zhì)體的粒徑及形態(tài)進(jìn)行表征，并測定了脂質(zhì)體的包封率和藥脂比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，G-50微柱對傳統(tǒng)脂質(zhì)體的回收率和游離MTX的吸附率都達(dá)到了90％以上，適合分離脂質(zhì)體與游離MTX;傳統(tǒng)脂質(zhì)體的

4、粒徑分布主峰約在1μm，脂質(zhì)體呈圓形，包封率約4％。
　　2)MTX脂質(zhì)體對巨噬細(xì)胞的毒性效應(yīng)研究
　　利用L929上清和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)成功誘導(dǎo)出骨髓來源的巨噬細(xì)胞(Bone Marrow-Derived Macrophage，BMDM);利用酸性磷酸酶法對培養(yǎng)出的BMDM進(jìn)行鑒定;使用高內(nèi)涵顯微鏡測定細(xì)胞對脂質(zhì)體的吞噬，利用MTS

5、對細(xì)胞毒性進(jìn)行測定。結(jié)果表明，M-CSF誘導(dǎo)的BMDM比L929上清誘導(dǎo)的BMDM細(xì)胞形態(tài)更均一，細(xì)胞活性更高，細(xì)胞純度達(dá)到90％以上;BMDM和RAW264.7對脂質(zhì)體都能高效攝取，且呈明顯的時(shí)間和劑量依賴性，BMDM的攝取能力明顯高于RAW264.7; MTX脂質(zhì)體對BMDM和RAW264.7細(xì)胞都存在明顯的毒性作用，且顯著高于同劑量的游離MTX。
　　3)傳統(tǒng)脂質(zhì)體和PEG修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體的初步藥動(dòng)學(xué)研究
　　制備了

6、傳統(tǒng)空白脂質(zhì)體和PEG修飾的長循環(huán)空白脂質(zhì)體并用DiR進(jìn)行標(biāo)記。尾靜脈分別注入CT26結(jié)腸癌移植瘤模型和3-甲基膽蒽誘發(fā)瘤模型小鼠體內(nèi)后，利用活體成像儀觀察了兩種脂質(zhì)體的生物分布情況。研究結(jié)果表明，CT26細(xì)胞和3-甲基膽蒽均能成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腫瘤，成瘤率在90％以上;傳統(tǒng)脂質(zhì)體更容易被肝脾巨噬細(xì)胞所吞噬，而PEG修飾的脂質(zhì)體則更容易通過EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤。
　　4)MTX長循環(huán)脂質(zhì)體的制備和對人骨肉瘤細(xì)胞的體外抗瘤活性研究

7、>　　采用薄膜分散法制備傳統(tǒng)甲氨蝶呤脂質(zhì)體(MTX-LIP)，后插入法制備甲氨蝶呤長循環(huán)脂質(zhì)體(PEG2000-MTX-LIP)，并用超速離心法、G-10微柱離心法和G-50微柱離心法去除未包載的游離藥物，對三種方法純化后脂質(zhì)體的回收率、粒徑、形態(tài)、包封率及藥脂比等理化性質(zhì)進(jìn)行表征;用MTS法研究經(jīng)超速離心法和G-50微柱法純化后的PEG2000-MTX-LIP對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的毒性。研究結(jié)果表明，G-50微柱離心法是最合適的M

8、TX脂質(zhì)體純化方法，具有回收完全和快速的優(yōu)點(diǎn);制備的MTX長循環(huán)脂質(zhì)體粒徑約在200 nm，粒徑分布窄，粒徑均勻，各種純化方法對脂質(zhì)體粒徑影響較小;相比游離MTX，MTX脂質(zhì)體對MG-63具有顯著增強(qiáng)的體外抗瘤活性，在人骨肉瘤的化療上有潛在的應(yīng)用前景。
　　綜上所述，實(shí)驗(yàn)中制備的傳統(tǒng)MTX脂質(zhì)體對BMDM和RAW264.7細(xì)胞都具有明顯毒性，DiR標(biāo)記的傳統(tǒng)脂質(zhì)體和PEG修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體在體表現(xiàn)出了不同的藥動(dòng)學(xué)特性，前者優(yōu)先被血