無莢膜流感嗜血桿菌DNA通過STING信號通路誘導免疫應答的初步研究.pdf

1、目的：
　　探究無莢膜流感嗜血桿菌DNA(NTHI-DNA)在NTHI誘導免疫應答中的作用，并對其應答機制進行研究。
　　背景：
　　無莢膜流感嗜血桿菌(NTHI)是一種常見的革蘭陰性菌，正常情況下，作為條件致病菌定植于上呼吸道，但當免疫力低下時可以移行至下呼吸道，誘發(fā)感染性疾病。一直以來，NTHI作為胞外菌被人們所熟知；但現(xiàn)有研究證實，NTHI也可以內化進入細胞。內化的細菌可以躲避高濃度的抗生素，這是中耳炎和慢性阻塞

2、性肺疾病(COPD)加重的重要原因。在肺炎鏈球菌、李斯特菌、結核分枝桿菌等多個感染模型中已證實細菌DNA可以被胞內DNA識別受體所識別進而誘導一系列信號通路開放，其中干擾素刺激基因(STING)介導的I型干擾素(I-IFN)產生是DNA免疫中最典型的信號通路。目前尚未有NTHI-DNA可以誘導機體免疫應答的報道。因此，本研究我們將對NTHI-DNA通過STING信號通路誘導I-IFN產生的機制進行探究。
　　主要研究方法：

3、　　1.采用抗生素保護實驗(APA)檢測NTHI感染后，IFN-β和CXCL10的表達，了解內化NTHI誘導免疫應答的能力；提取NTHI-DNA分別刺激上皮細胞和巨噬細胞，并檢測I-IFN和CXCL10的表達，初步證實NTHI-DNA作為免疫刺激物可誘導機體免疫應答。
　　2.初步檢測NTHI感染后細胞中幾種常見DNA識別受體的表達；干擾RNA(siRNA)特異性敲低MEF細胞中cGAS的表達，檢測cGAS對內化NTHI及NTHI

4、-DNA誘導I-IFN及CXCL10的影響。
　　3.分別比較NTHI-DNA刺激下，STING野生細胞(MEFWT)與STING缺陷細胞(MEFSTING-/-)以及HEK293T細胞中空載組與過表達STING組誘導IFN-β及CXCL10的差異，證實STING在NTHI-DNA介導免疫應答中的作用。比較NTHI-DNA刺激后，HEK293T細胞中空載組、過表達TBK1組、過表達TBK1(ΔULD)組誘導IFN-β及CXCL10

5、的差異，明確TBK1在NTHI-DNA誘導免疫應答中扮演的角色。NTHI-DNA刺激下，采用免疫熒光技術檢測細胞核內p-IRF3的表達；比較HEK293T細胞中空載組與過表達IRF3組誘導IFN-β及CXCL10的差異，了解IRF3對NTHI-DNA誘導免疫答的影響。
　　主要實驗結果：
　　1.內化NTHI及NTHI-DNA均可誘導I-IFN及CXCL10表達上調，且在RAW264.7細胞中觀察到，NTHI-DNA誘導I-

6、IFN及CXCL10具有時間依賴性。
　　2.DNA受體檢測結果顯示：NTHI感染后，BEAS-2B細胞中cGAS和IFI16的表達上調；并且cGAS的表達與內化進入胞內的NTHI數(shù)量成正比。siRNA特異性敲低cGAS后，會抑制內化NTHI及NTHI-DNA誘導I-IFN的表達。
　　3.相比于STING野生細胞(MEFWT)，STING缺陷細胞(MEFSTING-/-)誘導I-IFN及CXCL10的能力被顯著抑制。與空載

7、組相比較，HEK293T過表達STING可以促進IFN-β的表達；過表TBK1后IFN-β和CXCL10的表達也顯著上調，然而過表達TBK1(ΔULD)對IFN-β和CXCL10并無顯著影響。免疫熒光結果顯示，NTHI-DNA可以誘導細胞核內的p-IRF3表達上調；過表達IRF3能夠上調NTHI-DNA介導的IFN-β。
　　總結與討論：
　　胞內NTHI-DNA通過STING信號通路誘導上皮細胞和巨噬細胞產生I-IFN和C