副豬嗜血桿菌感染致炎癥相關(guān)信號(hào)通路的研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（HPS）引起的格拉澤氏病(Gl(a)sser's disease)成為當(dāng)前豬場(chǎng)最重要的細(xì)菌性傳染病之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。HPS感染最顯著的特點(diǎn)是引起豬非常嚴(yán)重的全身性炎癥反應(yīng)，包括多發(fā)性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。目前對(duì)HPS感染引起炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制尚不清楚，鑒于此，本課題以炎癥或細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)信號(hào)通路為研究突破口，解析了HPS感染細(xì)胞激活TLR/NF-κB、TLR/MAPK和Wnt/β-caten

2、in信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制，探討感染后生物學(xué)效應(yīng)和細(xì)胞間黏附連接機(jī)制，為進(jìn)一步研究HPS感染機(jī)制和致病機(jī)理提供依據(jù)。具體內(nèi)容如下:
　　1.HPS感染PK-15細(xì)胞激活TLR/NF-κB信號(hào)通路
　　(1) HPS感染PK-15細(xì)胞激活NF-κB信號(hào)通路：Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示HPS感染導(dǎo)致受NF-κB調(diào)控的炎癥因子IL-8、CCL4和CCL5顯著上調(diào)表達(dá)，且NF-κB抑制劑BAY11-7082處理細(xì)胞

3、后顯著下調(diào)IL-8和CCL4的表達(dá);Western blot證實(shí)HPS感染后IκBα降解和p65磷酸化，且激光共聚焦顯微鏡觀察到NF-κB核轉(zhuǎn)位;熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)HPS感染PK-15細(xì)胞后呈時(shí)間和劑量依賴激活NF-κB。
　　(2) TLRs和接頭分子在HPS感染PK-15細(xì)胞激活NF-κB中作用：轉(zhuǎn)染TLRs和接頭分子的干擾分子后NF-κB激活受到抑制，Western blot檢測(cè)HPS感染后TLR1、TLR2、TLR4、T

4、LR6和TRAF6蛋白表達(dá)水平隨感染時(shí)間增加而上升，表明HPS感染PK-15細(xì)胞通過TLR信號(hào)途徑激活NF-κB。
　　2.HPS感染PK-15細(xì)胞激活TLR/MAPK信號(hào)通路
　　(1) HPS感染PK-15細(xì)胞激活p38和JNK MAPK信號(hào)通路：Real-time RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SB202190(p38抑制劑)和SP600125(JNK抑制劑)顯著下調(diào)HPS誘導(dǎo)的IL-8和CCL4表達(dá)，Western blot證

5、實(shí)HPS感染后p-p38和p-JNK表達(dá)量上升，但p-ERK表達(dá)量不變，說明HPS感染激活p38和JNK MAPK信號(hào)通路，但不激活ERK。
　　(2) HPS感染PK-15細(xì)胞激活p38和JNK MAPK信號(hào)通路需要TLR參與：通過干擾分子實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染psiTLR1、psiTLR2、psiTLR4和psiTLR6后p-p38和p-JNK明顯下調(diào)，而p-ERK在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中沒有變化。綜合以上結(jié)果表明HPS感染PK-15細(xì)胞通過TLR

6、1、TLR2、TLR4和TLR6激活p38和JNK MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致炎癥因子產(chǎn)生，而ERK信號(hào)通路不參與其中。
　　3.HPS感染PK-15細(xì)胞激活RANTES轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制
　　(1) HPS感染PK-15細(xì)胞激活RANTES需要NF-κB信號(hào)通路參與：通過啟動(dòng)子突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RANTES啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)NF-κB、CRE和ISRE位點(diǎn)在HPS誘導(dǎo)RANTES轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用，其中NF-κB作用最顯著。加入IκBα負(fù)調(diào)控

7、突變體或抑制劑BAY11-7082都能顯著下調(diào)HPS誘導(dǎo)的RANTES的轉(zhuǎn)錄，說明HPS感染激活RANTES通過NF-κB信號(hào)通路。
　　(2) HPS感染PK-15細(xì)胞激活RANTES需要MAPK信號(hào)通路參與：通過抑制劑實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HPS感染后SP600125(JNK抑制劑)處理細(xì)胞顯著下調(diào)HPS誘導(dǎo)的RANTES表達(dá)，而SB202190和U0126并沒有此作用。轉(zhuǎn)入JNK突變體能顯著下調(diào)RANTES表達(dá)，而ERK突變體卻不能。說明

8、HPS感染激活RANTES通過JNK MAPK信號(hào)通路。
　　(3) HPS感染PK-15細(xì)胞激活RANTES需要TLR信號(hào)通路參與：轉(zhuǎn)入TLRs和接頭分子的干擾分子及負(fù)調(diào)控突變體能明顯下調(diào)RANTES的表達(dá)。綜合以上結(jié)果表明HPS感染通過TLR1/TLR2/TLR4/TLR6-MyD88/TRIF-NF-κB和JNK MAPK信號(hào)通路激活RANTES。
　　4.HPS感染PK-15細(xì)胞和NPTR細(xì)胞激活Wnt/β-cate

9、nin信號(hào)通路
　　(1) HPS感染PK-15和NPTR細(xì)胞激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路：雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)HPS感染PK-15和NPTR細(xì)胞能激活Wnt/β-catenin，Western blot驗(yàn)證HPS感染后p-β-catenin降低和p-GSK3β增加，且激光共聚焦顯微鏡也觀察到了HPS感染后β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位，β-catenin參與調(diào)控的Wnt通路下游靶基因MMP7、COX2和PAI-1在HP

10、S感染后明顯上調(diào)，這些靶基因在不同程度導(dǎo)致細(xì)胞移動(dòng)性增強(qiáng)和黏附性減弱。
　　(2) HPS感染PK-15和NPTR細(xì)胞對(duì)黏附連接的作用：細(xì)胞黏附連接主要由β-catenin和E-cadherin組成，前期研究已證實(shí)HPS感染后β-catenin由細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，現(xiàn)通過Western blot和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)到HPS感染后細(xì)胞膜上E-cadherin明顯減少，且通過免疫共沉淀和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)到HPS感染后β-ca

11、tenin和E-cadherin之間的相互作用明顯減弱，說明細(xì)胞之間的黏附連接作用減弱，直接導(dǎo)致細(xì)胞之間的黏附作用遭到破壞，使細(xì)菌更易侵入細(xì)胞，進(jìn)而侵入全身各組織器官導(dǎo)致機(jī)體全身性炎癥反應(yīng)。
　　總之，本研究首次報(bào)道了HPS感染激活炎癥相關(guān)信號(hào)通路，如NF-κB信號(hào)通路、TLR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和Wnt/β-catenin信號(hào)通路等，解析了趨化因子IL-8、CCL4和RANTES產(chǎn)生的分子機(jī)制，并從全新的角度闡述了HPS感