副豬嗜血桿菌感染致炎癥相關信號通路的研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（HPS）引起的格拉澤氏病(Gl(a)sser's disease)成為當前豬場最重要的細菌性傳染病之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。HPS感染最顯著的特點是引起豬非常嚴重的全身性炎癥反應，包括多發(fā)性漿膜炎、多發(fā)性關節(jié)炎和腦膜炎等。目前對HPS感染引起炎癥反應的分子機制尚不清楚，鑒于此，本課題以炎癥或細胞生長分化相關信號通路為研究突破口，解析了HPS感染細胞激活TLR/NF-κB、TLR/MAPK和Wnt/β-caten

2、in信號轉導通路的分子機制，探討感染后生物學效應和細胞間黏附連接機制，為進一步研究HPS感染機制和致病機理提供依據(jù)。具體內(nèi)容如下:
　　1.HPS感染PK-15細胞激活TLR/NF-κB信號通路
　　(1) HPS感染PK-15細胞激活NF-κB信號通路：Real-time RT-PCR檢測結果顯示HPS感染導致受NF-κB調控的炎癥因子IL-8、CCL4和CCL5顯著上調表達，且NF-κB抑制劑BAY11-7082處理細胞

3、后顯著下調IL-8和CCL4的表達;Western blot證實HPS感染后IκBα降解和p65磷酸化，且激光共聚焦顯微鏡觀察到NF-κB核轉位;熒光素酶報告系統(tǒng)檢測HPS感染PK-15細胞后呈時間和劑量依賴激活NF-κB。
　　(2) TLRs和接頭分子在HPS感染PK-15細胞激活NF-κB中作用：轉染TLRs和接頭分子的干擾分子后NF-κB激活受到抑制，Western blot檢測HPS感染后TLR1、TLR2、TLR4、T

4、LR6和TRAF6蛋白表達水平隨感染時間增加而上升，表明HPS感染PK-15細胞通過TLR信號途徑激活NF-κB。
　　2.HPS感染PK-15細胞激活TLR/MAPK信號通路
　　(1) HPS感染PK-15細胞激活p38和JNK MAPK信號通路：Real-time RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SB202190(p38抑制劑)和SP600125(JNK抑制劑)顯著下調HPS誘導的IL-8和CCL4表達，Western blot證

5、實HPS感染后p-p38和p-JNK表達量上升，但p-ERK表達量不變，說明HPS感染激活p38和JNK MAPK信號通路，但不激活ERK。
　　(2) HPS感染PK-15細胞激活p38和JNK MAPK信號通路需要TLR參與：通過干擾分子實驗發(fā)現(xiàn)轉染psiTLR1、psiTLR2、psiTLR4和psiTLR6后p-p38和p-JNK明顯下調，而p-ERK在整個實驗中沒有變化。綜合以上結果表明HPS感染PK-15細胞通過TLR

6、1、TLR2、TLR4和TLR6激活p38和JNK MAPK信號通路導致炎癥因子產(chǎn)生，而ERK信號通路不參與其中。
　　3.HPS感染PK-15細胞激活RANTES轉錄調控機制
　　(1) HPS感染PK-15細胞激活RANTES需要NF-κB信號通路參與：通過啟動子突變實驗發(fā)現(xiàn)，RANTES啟動子結合位點NF-κB、CRE和ISRE位點在HPS誘導RANTES轉錄中發(fā)揮重要作用，其中NF-κB作用最顯著。加入IκBα負調控

7、突變體或抑制劑BAY11-7082都能顯著下調HPS誘導的RANTES的轉錄，說明HPS感染激活RANTES通過NF-κB信號通路。
　　(2) HPS感染PK-15細胞激活RANTES需要MAPK信號通路參與：通過抑制劑實驗發(fā)現(xiàn)HPS感染后SP600125(JNK抑制劑)處理細胞顯著下調HPS誘導的RANTES表達，而SB202190和U0126并沒有此作用。轉入JNK突變體能顯著下調RANTES表達，而ERK突變體卻不能。說明

8、HPS感染激活RANTES通過JNK MAPK信號通路。
　　(3) HPS感染PK-15細胞激活RANTES需要TLR信號通路參與：轉入TLRs和接頭分子的干擾分子及負調控突變體能明顯下調RANTES的表達。綜合以上結果表明HPS感染通過TLR1/TLR2/TLR4/TLR6-MyD88/TRIF-NF-κB和JNK MAPK信號通路激活RANTES。
　　4.HPS感染PK-15細胞和NPTR細胞激活Wnt/β-cate

9、nin信號通路
　　(1) HPS感染PK-15和NPTR細胞激活Wnt/β-catenin信號通路：雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實HPS感染PK-15和NPTR細胞能激活Wnt/β-catenin，Western blot驗證HPS感染后p-β-catenin降低和p-GSK3β增加，且激光共聚焦顯微鏡也觀察到了HPS感染后β-catenin發(fā)生核轉位，β-catenin參與調控的Wnt通路下游靶基因MMP7、COX2和PAI-1在HP

10、S感染后明顯上調，這些靶基因在不同程度導致細胞移動性增強和黏附性減弱。
　　(2) HPS感染PK-15和NPTR細胞對黏附連接的作用：細胞黏附連接主要由β-catenin和E-cadherin組成，前期研究已證實HPS感染后β-catenin由細胞膜向細胞質和細胞核轉移，現(xiàn)通過Western blot和激光共聚焦技術檢測到HPS感染后細胞膜上E-cadherin明顯減少，且通過免疫共沉淀和激光共聚焦技術檢測到HPS感染后β-ca

11、tenin和E-cadherin之間的相互作用明顯減弱，說明細胞之間的黏附連接作用減弱，直接導致細胞之間的黏附作用遭到破壞，使細菌更易侵入細胞，進而侵入全身各組織器官導致機體全身性炎癥反應。
　　總之，本研究首次報道了HPS感染激活炎癥相關信號通路，如NF-κB信號通路、TLR信號通路、MAPK信號通路和Wnt/β-catenin信號通路等，解析了趨化因子IL-8、CCL4和RANTES產(chǎn)生的分子機制，并從全新的角度闡述了HPS感