大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥對(duì)流感嗜血桿菌生物被膜的影響.pdf

1、細(xì)菌生物被膜(bacteria biofilm BBF)可減弱細(xì)菌對(duì)抗菌藥的敏感性，降低膜內(nèi)藥物的有效濃度，導(dǎo)致細(xì)菌不能徹底清除，疾病反復(fù)發(fā)作。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulanonary diseases COPD)是臨床常見的呼吸道疾病，居全球死亡原因的第4位。慢性阻塞性肺疾病急性發(fā)作(Acute ExplosionChronic Obstructive Pulmonary Diseases AEC

2、OPD)感染的特點(diǎn)是慢性過程急性反復(fù)發(fā)作，與BBF相關(guān)感染特點(diǎn)極其相似。流感嗜血桿菌是是導(dǎo)致AECOPD的主要致病菌之一。研究證實(shí)流感嗜血桿菌可在體外建立生物被膜，并逃逸抗菌藥及免疫系統(tǒng)的攻擊，提示流感嗜血桿菌BBF與AECOPD等慢性疾病的病程進(jìn)展可能相關(guān)。COPD患者行機(jī)械通氣呼吸機(jī)相關(guān)肺炎(ventilatorassociated pneumonia VAP)的發(fā)病率和死亡率均較高。氣管導(dǎo)管生物被膜感染是導(dǎo)致VAP的原因之一。

3、r>　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過建立流感嗜血桿菌體外和慢性支氣管炎大鼠體內(nèi)及氣管導(dǎo)管生物被膜模型，并給予不同濃度大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥(紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素)干預(yù)，探討大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥對(duì)流感嗜血桿菌生物被膜的影響。
　　 方法：通過結(jié)晶紫染色及掃描電鏡鑒定體外建立流感嗜血桿菌生物被膜；通過結(jié)晶紫染色評(píng)價(jià)不同濃度大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對(duì)流感嗜血桿菌早期生物被膜形成的影響及對(duì)成熟生物被膜的破壞作用，以篩選出抑制作用好的藥物；通過掃描電鏡觀察

4、藥物對(duì)生物被膜基本結(jié)構(gòu)的破壞；通過菌落計(jì)數(shù)觀察藥物對(duì)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的抑制作用。通過熏煙結(jié)合脂多糖氣道內(nèi)滴入法建立慢性支氣管炎大鼠模型；通過瓊脂珠包被菌體氣道滴入法建立慢性支氣管炎大鼠流感嗜血桿菌急性感染模型；通過肺泡灌洗液、肺組織勻漿菌落計(jì)數(shù)及掃描電鏡、病理切片觀察慢支急性發(fā)作大鼠肺內(nèi)生物被膜的形成；通過肺泡灌洗液、肺組織勻漿菌落計(jì)數(shù)和大鼠肺泡灌洗液及血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平的變化，評(píng)價(jià)阿奇霉素灌胃治療流感嗜血桿菌感染慢

5、支大鼠的作用。并評(píng)價(jià)各炎性因子在慢支急性發(fā)作中的地位。采用慢性支氣管炎大鼠氣管置管，給予細(xì)菌氣道滴入流感嗜血桿菌造成氣管插管感染模型，并在掃描電鏡下觀察氣管內(nèi)導(dǎo)管生物被膜形成情況。通過氣管導(dǎo)管菌落計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)阿奇霉素在治療氣管導(dǎo)管生物被膜的作用。
　　 結(jié)果：通過結(jié)晶紫染色及掃描電鏡證實(shí)體外成功建立流感嗜血桿菌生物被膜；通過結(jié)晶紫染色觀察到，流感嗜血桿菌在亞MIC濃度仍可形成生物被膜，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥對(duì)生物被膜有一定抑制作用。其中在

6、對(duì)早期生物被膜抑制作用的觀察中，阿奇霉素組隨藥物濃度的增高形成的生物被膜的能力減弱，但同樣為大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的羅紅霉素和紅霉素組，在1/8MIC濃度時(shí)形成生物被膜的能力較其它濃度為高(P<0.05)，甚至高于無藥對(duì)照組；在對(duì)成熟生物被膜破壞作用的結(jié)果顯示，阿奇霉素組隨藥物濃度的升高對(duì)生物被膜的破壞力越強(qiáng)，并且，亞MIC的阿奇霉素對(duì)成熟生物被膜也顯示出了一定的破壞作用。通過掃描電鏡及菌落計(jì)數(shù)進(jìn)一步觀察阿奇霉素對(duì)生物被膜影響的結(jié)果顯示阿奇

7、霉素可破壞生物被膜的基本結(jié)構(gòu)，使被膜表面粗糙、結(jié)構(gòu)疏松，并且在1/8MIC～8MIC濃度可不同程度的抑制生物被膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)，但是在8MIC時(shí)仍未能徹底清除膜內(nèi)細(xì)菌。慢性支氣管炎模型組動(dòng)物的氣道組織病理學(xué)可見支氣管黏膜上皮纖毛倒伏、脫落、管腔分泌物增多、炎細(xì)泡浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生、平滑肌斷裂。對(duì)照組氣道黏膜上皮完整，纖毛無黏連、脫落，未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組和慢支組大鼠肺泡灌洗液和肺組織勻漿細(xì)菌數(shù)在第一天時(shí)接種數(shù)均為107以上，病理顯示對(duì)照組肺

8、泡腔、氣管旁及肺間質(zhì)均出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，肺組織呈實(shí)變；慢支組肺泡腔及肺間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，炎細(xì)胞在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)中性粒細(xì)胞，且肺泡腔滲出明顯，部分呈實(shí)變；提示急性感染模型成功建立。慢支組肺組織勻漿中細(xì)菌數(shù)顯示在2周時(shí)最低，至一月時(shí)仍保持在102，且略有升高趨勢(shì)。掃描電鏡觀察慢支感染大鼠肺組織內(nèi)可見一外被膜樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)，內(nèi)呈顆粒改變，結(jié)合光鏡下可見肉芽腫內(nèi)異物巨細(xì)胞包繞下被染成黑色顆粒狀的菌體.阿奇霉素作用

9、于慢支急性發(fā)作大鼠結(jié)果顯示，肺泡灌洗液菌落計(jì)數(shù)中，給藥組與慢支組相比細(xì)菌清除時(shí)間明顯提前，在肺組織勻漿中慢支組及給藥組一月時(shí)細(xì)菌仍未能徹底清除，但從細(xì)菌計(jì)數(shù)來看給藥組較慢支組明顯減少；病理顯示給予阿奇霉素治療后與未用藥物干預(yù)組同期相比炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肺泡腔滲出吸收；三種炎性因子數(shù)值給藥組均較感染組明顯降低。當(dāng)肺泡灌洗液中細(xì)菌數(shù)高時(shí)三種細(xì)胞炎性因子水平均較高，并隨細(xì)菌數(shù)減少，數(shù)值不同程度下降，且當(dāng)肺組織內(nèi)有細(xì)菌定植時(shí)，炎性因子水平高于

10、對(duì)照組，低于感染組。給藥組IL-6及IL-8肺泡灌洗液中數(shù)值在一周左右時(shí)低于對(duì)照組。掃描電鏡可見導(dǎo)管上生長(zhǎng)的生物被膜表面凹凸不平，并見大量胞外基質(zhì)包被下的細(xì)長(zhǎng)菌體，證實(shí)流感嗜血桿菌可在氣管內(nèi)導(dǎo)管形成生物被膜。阿奇霉素作用后，氣管導(dǎo)管生物被膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)與未用藥相比有所下降，但一月后與未用藥相比無明顯差異。
　　 結(jié)論：流感嗜血桿菌可在體外形成生物被膜。流感嗜血桿菌在大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥(阿奇霉素、羅紅霉素、紅霉素)亞MIC濃度時(shí)可形成生

11、物被膜。大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥對(duì)生物被膜有一定破壞作用，其中阿奇霉素作用最強(qiáng)。高濃度及亞MIC濃度阿奇霉素均可影響生物被膜黏附性、破壞生物被膜基本結(jié)構(gòu)，并可減少膜內(nèi)活菌數(shù)，但不能完全清除膜內(nèi)細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)成功建立慢性支氣管炎及慢性支氣管炎流感嗜血桿菌急性感染大鼠模型并在慢性支氣管炎大鼠體內(nèi)可見生物被膜樣物質(zhì)。阿奇霉素對(duì)慢支流感嗜血桿菌生物被膜感染大鼠急性期及生物被膜內(nèi)細(xì)菌均有較好治療作用。細(xì)胞炎性因子可作為評(píng)價(jià)感染程度的指標(biāo)。阿奇霉素有抑制大鼠