分泌廣譜抗菌肽乳酸菌的篩選及高效表達(dá)的調(diào)控研究.pdf

1、食品防腐劑對提高食品保藏性和延長食品保質(zhì)期具有重要作用?，F(xiàn)在使用的防腐劑仍以化學(xué)防腐劑為主，存在食品安全隱患。Nisin是世界公認(rèn)安全的天然食品防腐劑；但Nisin抗菌譜較窄，只能抑制革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母菌、霉菌及病毒無抑制作用。以Pediocin為代表的ClassⅡa類細(xì)菌素具有抑菌譜廣、穩(wěn)定性高、分散性好、安全高效等優(yōu)點(diǎn)倍受關(guān)注，但生物合成量低是其產(chǎn)業(yè)化瓶頸。本研究從我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選到一株對典型革蘭氏陽性和革蘭

2、氏陰性食品腐敗菌均具有抑制作用的Lactobacillus paracasei-J23，經(jīng)研究確定發(fā)揮抗菌作用的為肽類物質(zhì)Bac-J23，進(jìn)一步研究了Bac-J23的分離純化、理化特性及生物學(xué)信息、合成條件優(yōu)化以及活性修飾與應(yīng)用影響因素。
　　根據(jù)ClassⅡa抗菌肽N-端保守氨基酸序列（-YGNGV-）這一特征，建立了基于Colony-PCR法的產(chǎn)ClassⅡa抗菌肽乳酸菌高通量篩選方法；利用此方法從分離于我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的27

3、5株乳酸菌中篩選得到抑菌活力和抗菌譜均有明顯優(yōu)勢的ClassⅡa抗菌肽產(chǎn)生菌株1株，經(jīng)Biolog鑒定系統(tǒng)和16SrDNA從代謝水平和分子水平上鑒定為Lactobacillus paracasei，并確定了抗菌物質(zhì)為多肽類物質(zhì)Bac-J23。聯(lián)合菌體細(xì)胞吸附-解吸法、陽離子交換法和疏水層析法對Bac-J23進(jìn)行了分離純化，純化倍數(shù)和回收率分別為45.1和16.4％。Bac-J23純化樣品在Tricine-SDS-PAGE電泳上呈單一條帶

4、，分子量近似為6.56KD，HPLC色譜呈單一峰。Bac-J23的N-端部分氨基酸序列研究表明，Bac-J23的N-端序列為：(K, N, D)-Y-G-N-V-G(V)-V-(A,F)-(V,F)，具有明顯的ClassⅡa抗菌肽特征。
　　Bac-J23的理化性質(zhì)研究及相關(guān)生物學(xué)特性預(yù)測結(jié)果表明，Bac-J23疏水性氨基酸含量豐富，含有一種未知氨基酸。Bac-J23理論等電點(diǎn)為9.145，實(shí)測等電點(diǎn)為8.9，280nm消光系數(shù)為

5、ε=27850L/mol/cm。DSC分析Bac-J23凍干樣品的變性溫度為86.35℃，焓變?yōu)?6.49J/g。Bac-J23在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，對蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶敏感，不能被胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶水解。Bac-J23巰基和二硫鍵含量分別為10.18mol/106g和21.15mol/106g。亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)預(yù)測表明Bac-J23為分泌型多肽，為非膜蛋白，無跨膜區(qū)存在。同源性分析表明，相似度較高的為來源于Lactob

6、acillales、Enterococcaceae、Enterococcus產(chǎn)生的一種暫命名為Enterocin E-760的抗菌肽。
　　Bac-J23的發(fā)酵合成條件研究表明，Lactobacillus paracasei-J23生產(chǎn)Bac-J23體現(xiàn)出溫度、pH梯度和接種劑量依賴性，響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明最適溫度和pH分別為36.8℃和5.2，接種量閾值為2.13×104CFU/ml。最適培養(yǎng)基組分為蔗糖（20g/L）、酵母提取物

7、（0.5%）、牛肉膏（1%）、KH2PO4（20g/L）、檸檬酸氫二銨（0.2%）、MgSO4（0.2g/L）、MnSO4（0.25g/L）。在優(yōu)化條件下，Bac-J23合成量提高1.68倍，達(dá)到5400U/ml?；谌后w感應(yīng)系統(tǒng)對Bac-J23的合成調(diào)控研究表明，Bac-J23的合成受其自身誘導(dǎo)調(diào)控，具有誘導(dǎo)作用的Bac-J23閾值為2.5×10-10M，當(dāng)添加量超過6.4×10-8M，Bac-J23合成達(dá)到飽和量3200U/ml；B

8、ac-J23的誘導(dǎo)作用表現(xiàn)出時效性，僅在Lactobacillus paracasei-J23對數(shù)生長末期之前添加表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)。利用靜息細(xì)胞技術(shù)篩選Bac-J23的合成誘導(dǎo)物研究表明，甘油、半胱氨酸、甘氨酸、丙酮酸對Bac-J23合成具有誘導(dǎo)作用，最高可使Bac-J23活力提高4倍，而谷氨酸、酪氨酸,丙氨酸等均未檢測到誘導(dǎo)作用。Lactobacillus paracasei-J23與大腸桿菌和枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)有利于Bac-J23的生

9、物合成，但兩種指示菌分泌的Bac-J23合成誘導(dǎo)物分別存在于發(fā)酵上清液和菌體細(xì)胞內(nèi)部，且與兩種菌的接種量有關(guān)。大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的接種量閾值分別為1.8×104CFU/ml和5.2×104CFU/ml，可使Bac-J23合成量提高2-6倍。
　　Bac-J23有限水解修飾研究結(jié)果表明，經(jīng)蛋白酶K與胰蛋白酶酶解后均出現(xiàn)兩種主要產(chǎn)物，分子量分別為4.5KD、1.9KD、3.8KD和2.5KD。Bac-J23酶解后喪失了與敏感菌細(xì)胞

10、結(jié)合能力和體內(nèi)抗菌活性，但是體外抗菌活力增強(qiáng)，體外抗菌物質(zhì)主要是Bac-K2和Bac-T2。食品成分和相關(guān)環(huán)境對Bac-J23的活性影響研究表明，酪蛋白和卵磷脂對 Bac-J23抗菌活力具有負(fù)面影響，當(dāng)卵磷脂濃度大于0.8％，Bac-J23對指示菌基本完全失去抗菌活性。EDTA和NaCl與Bac-J23共存時表現(xiàn)出聯(lián)合抗菌效應(yīng)，但當(dāng)食品環(huán)境中NaCl濃度大于6％，則完全抑制了Bac-J23的合成。Bac-J23常溫保存一年仍保留了接近5