抗菌肽類和酶類酵母異源表達的研究.pdf

1、抗生素的過量使用和濫用導致大量耐藥菌的出現(xiàn)，特別是超級耐藥菌的出現(xiàn)，對人類健康造成嚴重的威脅。尋找新的更為安全高效的抗生素，以及不易產(chǎn)生細菌耐藥性的抗生素替代物，對于保障人類健康，以及健康食品生產(chǎn)和動物養(yǎng)殖具有重要意義和迫切需求?？咕念愇镔|是天然抗菌物質，具有穩(wěn)定性好、無毒副作用、不會出現(xiàn)細菌耐藥性等突出優(yōu)點，也具有替代某些抗生素的潛力。因此，本項研究的目的是利用基因工程的方法，構建人工合成抗菌肽和抗菌酶基因的重組表達質粒，將重組質粒

2、導入畢赤酵母或乳酸克魯維酵母中進行異源表達，獲得了酵母表達的抗菌肽和抗菌酶，旨在為抗菌肽類物質的實際應用提供技術資料。本論文報道了幾種抗菌肽類物質和具有抗菌作用的葡萄氧化酶的酵母異源表達的主要研究結果。
　　1、構建了對革蘭氏陰性菌有很好抗性的抗菌肽AP基因重組表達載體pPICAP，將其導入畢赤酵母SMD1168中，獲得了抗E.coli的畢赤酵母菌株AP26，該菌株在培養(yǎng)的72 h時抑菌活性最高，之后抑菌活性降低，表明72 h時抗

3、菌肽AP的表達量最高。進一步研究表明，在培養(yǎng)的72h后，重組菌抑菌活性降低是因為發(fā)生了質粒的丟失。LC-MS結果表明重組菌株正確表達了抗菌肽AP。對菌株AP26進行了亞硝基胍(NTG)誘變，篩選到了抗菌肽AP表達量最高的誘變菌株APmu4，其抗菌肽AP最高生物效價達到1.7×109 U/L。對影響抗菌肽AP表達量的因素進行了研究，發(fā)現(xiàn)pH為7.5、接種量為50g/L、鹽濃度較高的YDFMY培養(yǎng)基、酵母提取物能夠提高抗菌肽AP的表達量。<

4、br>　　2、構建了具有廣譜抗菌活性的抗菌肽AB基因的重組載體pPICAB，將其導入到畢赤酵母SMD1168菌株中，獲得分泌表達抗菌肽AB的畢赤酵母菌株，該重組菌株對E.coti有抗性，LC-MS結果表明該菌株正確表達了抗菌肽AB。對重組菌株進行了NTG誘變，篩選到超量表達抗菌肽AB的誘變菌株ABN97。為了進一步提高誘變菌株抗菌肽AB表達量，構建了顫藻血紅蛋白基因vgb的重組載體，將其導入到菌株ABN97中，篩選出了抑菌效果最好的菌株

5、ABN97vgb，抗菌肽AB生物效價達到4.53×108 U/L。對影響抗菌肽AB表達量的因素進行了研究，發(fā)現(xiàn)pH為6.0、接種量為50 g/L、鹽濃度較高的YDFMY培養(yǎng)基、酵母提取物能夠提高抗菌肽AB的表達量，最高表達量提高了14倍。
　　3、構建了對革蘭氏陽性菌有良好抑菌活性的抗菌肽菌絲霉素Plectasin基因重組質粒pPICPle，將其導入畢赤酵母并成功異源表達抗菌肽Plectasin。對重組菌株進行NTG誘變并篩選得到

6、高效表達Plectasin的誘變菌株Ple100，其Plectasin的表達量提高了1.93倍。對影響菌株Ple100 Plectasin表達量的因素進行研究，結果表明鹽濃度較高的YDFMY培養(yǎng)基和酵母提取物能提高菌株Plectasin表達量。
　　4、構建了抗菌肽PSI基因的整合型載體pLACPSI和游離型載體pKDUPSI，將其導入到乳酸克魯維酵母K1SEL1基因突變型菌株中，篩選到分泌表達抗菌肽PSI的重組菌株。對重組菌株發(fā)

7、酵液中抗菌肽PSI進行硫酸銨沉淀法和陽離子交換柱純化，SDS-PAGE檢測驗證了抗菌肽PSI。對重組菌株產(chǎn)抗菌肽PSI的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結果表明中性或偏堿性、酵母提取物和鹽度較高的YDFMY培養(yǎng)基更有利于抗菌肽PSI的表達。純化的抗菌肽PSI對大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、三線鐮刀菌（Fusarfum tricinctum）、鏈格孢菌(Alternaria alternata)、灰霉菌（Botrytis ci

8、nerea）、平頭炭疽（Colletotrichumtruncatum）有抗性。水果保鮮實驗表明純化后的抗菌肽PSI也具有開發(fā)為新型果蔬保鮮劑的潛力。
　　5、構建了葡萄糖氧化酶(GOX)基因的整合型載體pLACGOX和游離型載體pKDUGOX，成功將其導入到乳酸克魯維酵母K1SEL1基因突變型菌株中，獲得了一株能超量分泌表達GOX的乳酸克魯維酵母菌株，其GOX最大表達量為70±7 kU/L，SDS-PAGE檢測驗證了GOX正確表