合浦珠母貝抗菌肽產(chǎn)生菌的篩選與初步應(yīng)用研究.pdf

1、合浦珠母貝(Pinctada fucata)是一種重要的海水養(yǎng)殖生產(chǎn)珍珠的母貝,復(fù)雜的的海洋生存環(huán)境及插入異物的特殊養(yǎng)殖過程等內(nèi)外因素都會使合浦珠母貝受到刺激,從而產(chǎn)生大量具有抗菌活性的物質(zhì)以增強(qiáng)免疫力。通過長期的進(jìn)化合浦珠母貝形成了特殊的體內(nèi)免疫機(jī)制,內(nèi)源性抗菌物質(zhì)豐富。研究表明,共附生的海洋微生物能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的生理活性成分,這些活性物質(zhì)具有很大的開發(fā)潛力。因此本文選取海南及深圳基地采集的合浦珠母貝,以其黏液作為原料分離篩

2、選抗菌肽產(chǎn)生菌,以期進(jìn)一步開發(fā)為天然食品防腐劑。本研究的主要內(nèi)容如下:
　　從海南及深圳水產(chǎn)養(yǎng)殖基地采集不同生長階段的合浦珠母貝,以其黏液作為分離材料,稀釋涂布于六種不同的分離培養(yǎng)基,對合浦珠母貝樣品中共附生微生物進(jìn)行分離純化。將純化后的菌株在適當(dāng)條件下發(fā)酵并收集取上清液,利用牛津杯擴(kuò)散法對單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希氏

3、菌(Escherichia coli)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)這八種指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),篩選抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌。
　　對篩選出對抑菌能力強(qiáng)、抑菌譜廣的菌株發(fā)酵液抗菌物質(zhì)進(jìn)行酸類抑制作用

4、的排除、過氧化氫抑制作用的排除以及蛋白酶敏感性來篩選抗菌蛋白或多肽產(chǎn)生菌株。對通過篩選的抗菌肽產(chǎn)生菌株進(jìn)行菌株形態(tài)、生理生化及16S rDNA序列分析鑒定。研究溫度、pH及傳代次數(shù)等因素對該菌株的影響。
　　對選定菌株的的發(fā)酵液進(jìn)行粗提取,并研究其粗提取物的分子量范圍、抑菌譜、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等因素對其抑菌活性的影響。將粗提物應(yīng)用于羅非魚片的防腐保鮮,通過考察冷藏過程中細(xì)菌總數(shù)、理化指標(biāo)以及感官評定對其抑菌效果進(jìn)行評價。

5、>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以3種不同地點(diǎn)采集的合浦珠母貝黏液為樣品,共分離得到127株菌株,其中具有抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌共31株,總體來看插核后的樣品中代謝產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)共附生菌比例高于插核前的樣品。從這31株抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌中篩選出的17株具有抑菌能力強(qiáng)、抑菌譜廣的菌株,經(jīng)過排除酸及過氧化氫的干擾作用實(shí)驗(yàn),以及四種蛋白酶酶解處理后,發(fā)現(xiàn)菌株SZAI09、SZAI17和SZAI35的發(fā)酵液中含有蛋白或多肽類抑菌成分,特別是菌株SZAI09抗菌

6、活性在酶解前后變化明顯。而且菌株SZAI09抗菌譜廣,抑菌能力強(qiáng),最終確定菌株SZAI09為優(yōu)良抗菌肽產(chǎn)生菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　根據(jù)菌株SZAI09菌落特征及生理生化結(jié)果初步鑒定為乳桿菌,其16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列中模式菌株Lactobacillus coryniformis subsp. torquens KCTC3535T序列相似性高達(dá)100％,確定菌株 SZAI09為棒狀乳桿菌(Lactobac

7、illus coryniformis)。菌株 SZAI09生物學(xué)特性研究表明菌株SZAI09具有的良好的遺傳穩(wěn)定性;最適生長溫度為30℃;最適pH為7.0;通過該菌株的生長曲線發(fā)現(xiàn)該菌的生長速度較快,在接種后培養(yǎng)24h左右時菌量最多。
　　當(dāng)硫酸銨飽和度為60%時,菌株 SZAI09發(fā)酵液析出的抗菌肽最多;該抗菌肽分子量主要集中在5000-10000Da范圍內(nèi),且對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都有抑菌作用,抑菌譜廣,其中對金黃色葡萄