腹膜透出液線粒體DNA含量與腹膜功能及腹膜炎預后關系的研究.pdf

1、第一部分透出液線粒體DNA含量與腹腔炎癥狀態(tài)及腹膜轉(zhuǎn)運功能的關系研究
　　目的:
　　維持性腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)患者腹膜局部長期處于慢性炎癥狀態(tài)，腹膜轉(zhuǎn)運功能與炎癥程度密切相關。研究證實線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)由受損或死亡細胞釋放入循環(huán)后可引起炎癥反應。mtDNA是否參與了PD患者腹腔慢性炎癥狀態(tài)目前不清楚。本研究旨在探討腹膜透出液中mtDNA與腹腔炎

2、癥狀態(tài)及腹膜轉(zhuǎn)運功能之間的關系。
　　方法:
　　選取2009年1月1日～2010年12月31日在我院接受開始維持性腹膜透析的終末期腎病患者。患者在第一次行腹膜平衡試驗(PET)時留取透出液標本，熒光定量PCR法檢測透出液上清液中mtDNA含量，ELISA法檢測IL-6、IL-17A、TNF-α和IFN-γ水平。記錄患者基本資料、實驗室檢查指標及生存預后資料等。應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:

3、　　符合研究納入標準的共有189例，男性105例，女性84例，平均年齡47.1±13.5歲，中位隨訪時間為41.9個月。所有患者平均腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率(Peritoneal solutetransport rate，PSTR)為0.66+0.12，其中高轉(zhuǎn)運18(9.5％)例，高平均轉(zhuǎn)運94(49.7％)例，低平均轉(zhuǎn)運57(30.2％)例，低轉(zhuǎn)運20(10.6％)例。腹膜透出液中位mtDNA含量為4325 copies/ul，IL-6濃度為

4、25.9pg/ml，IL-17A濃度為10.8pg/ml，TNF-α濃度為25.8pg/ml，IFN-γ濃度為17.9pg/ml。mtDNA與腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運率(r=0.461，P＜0.001)、IL-6(r=0.568，P＜0.001)、TNF-α(r=0.454，P＜0.001）和IFN-γ(r=0.203，P=0.005)均呈正相關。廣義線性回歸模型中，mtDNA是IL-6的獨立相關因素。女性、使用2.5％葡萄糖透析液、透析劑量、mt

5、DNA和IL-6是PSTR的獨立相關因素(P＜0.05）。不同mtDNA水平患者生存率無明顯差異，多因素Cox回歸結(jié)果顯示透出液mtDNA不是患者死亡及技術(shù)失敗的獨立危險因素(P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　透出液mtDNA與腹腔局部炎癥程度相關，并且是PSTR的獨立預測因素，但不是患者死亡和技術(shù)失敗的危險因素。
　　第二部分透出液線粒體DNA含量與腹膜炎預后的關系研究
　　目的:
　　腹膜透析相關性腹膜

6、炎是腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)患者最常見的并發(fā)癥之一。盡管近年來腹膜炎發(fā)生率有所下降，但其仍是導致PD患者死亡或技術(shù)失敗的重要原因。線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)能夠激活免疫系統(tǒng)引起免疫放大反應。研究表明，循環(huán)中mtDNA水平與創(chuàng)傷或膿毒血癥預后相關，但其在腹膜透析相關性腹膜炎中的作用尚不清楚。本研究旨在探討腹膜透出液中mtDNA含量與腹膜透析相關性腹膜炎預后的關系。

7、　　方法:
　　前瞻性選取2014年6月1日～2015年9月30日發(fā)生腹膜透析相關性腹膜炎并在我院就診的維持性腹膜透析患者。所有患者在腹膜炎第1天和第3天留取透出液標本，熒光定量PCR法檢測透出液中mtDNA、細菌DNA(Bacteria DNA，bDNA)含量，ELISA法檢測IL-6水平。記錄患者基本信息、實驗室檢查指標及腹膜炎治療結(jié)局等資料。隨訪期限為腹膜炎治療后1個月，將患者分為治愈組和退出組，應用SPSS19.0軟件進行

8、統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:
　　研究期間共發(fā)生237例腹膜炎，符合研究納入標準的共有94例，其中男性60例，女性34例，平均年齡為54.2±12.7歲，平均Charslon合并癥指數(shù)評分為3.4±1.5，中位透析齡24.9個月。第1天和第3天退出組透出液中mtDNA均顯著高于治愈組(P=0.004和P＜0.001);第1天兩組bDNA比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.093)，但第3天退出組bDNA顯著高于治愈組(P＜0.001)。

9、Pearson相關分析顯示第3天透出液mtDNA、 bDNA、IL-6、透出液白細胞及hs-CRP均呈正相關(P＜0.05），且相關性相比于第1天均有所提高。第1天和第3天mtDNA的AUC分別為0.772和0.894，bDNA的AUC為0.657和0.827，白細胞的AUC為0.472和0.788。根據(jù)第3天ROC曲線和約登指數(shù)最大原則，mtDNA截斷值約為163000 copies/ul(約登指數(shù)0.687，靈敏度72.7％，特異度

10、95.9％)，bDNA截斷值約為1700 copies/ul(約登指數(shù)0.710，靈敏度81.8％，特異度89.2％)，白細胞截斷值約為1220個/ul(約登指數(shù)0.596，靈敏度63.6％，特異度96.9％)。根據(jù)3個指標的截斷值將變量重新分為高低兩組。多元logistic回歸分析結(jié)果顯示mtDNA(OR=29.363，P=0.01)和bDNA(OR=12.151，P=0.037)為腹膜炎治療失敗的獨立危險因素。依據(jù)mtDNA和bDN

11、A建立風險預測模型，綜合風險評分(Summary Risk Score，SRS)模型公式=3.38*mtDNA(0或1)+2.497*bDNA(0或1)。模型ROC曲線下面積為0.887(95％CI0.742-1.000，P＜0.001)其預測腹膜炎治療失敗的靈敏度為72.7％，特異度為100％。
　　結(jié)論:
　　腹膜炎患者透出液中mtDNA水平與炎癥程度相關，并且是腹膜炎治療失敗的獨立危險因素。利用第3天透出液mtDNA和

12、bDNA水平預測腹膜炎預后有良好的準確度，可作為預測腹膜炎預后的新的標志物，需要大樣本研究進一步證實。
　　第三部分線粒體DNA誘導小鼠急性腹膜炎癥及其作用機制初步研究
　　目的:
　　腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)患者長期處于炎癥狀態(tài)，反復發(fā)生和持續(xù)存在的炎癥已被證實與腹膜透析的不良預后相關。線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)同細菌DNA(Bacterial DN

13、A，bDNA)一樣，含有大量未甲基化的CpG序列，能夠激活TLR9(Toll-like receptor9)，引起炎癥反應，造成組織器官損傷。另外，mtDNA還可能通過激活NLRP3炎癥體（inflammasome），從而促進IL-1β的表達和分泌，介導炎癥產(chǎn)生。作者研究中發(fā)現(xiàn)，無論在慢性PD患者還是發(fā)生急性腹膜炎的患者透出液中均檢測到mtDNA水平升高，并與炎癥程度呈正相關，同時影響腹膜轉(zhuǎn)運功能和腹膜炎預后。為此，我們將通過動物實驗進

14、一步探討mtDNA在腹膜炎癥發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能機制:(1)利用LPS造小鼠急性腹膜炎模型，驗證mtDNA在腹膜炎的作用;(2)探討mtDNA是否通過激活TLR9和NLRP3通路介導腹膜炎癥反應和損傷。
　　方法:
　　選取C57BL/6健康雄性小鼠，分為7組:生理鹽水組（對照組），低LPS組(2mg/kg)，高LPS組(10mg/kg)，低mtDNA組(0.2mg/kg)，高mtDNA組(1mg/kg)，低bDNA組（

15、0.2mg/kg），高bDNA組（1mg/kg）。腹腔注射各組干預藥物，在注射后6h和24h處死小鼠，處死前每只小鼠腹腔注射2ml生理鹽水，處死后吸取腹腔灌洗液，進行白細胞計數(shù)、PCR法檢測mtDNA水平、ELISA檢測IL-1β和IL-6含量;切取小鼠腹壁組織、網(wǎng)膜和腸系膜組織，HE和Masson染色觀察腹膜組織形態(tài)學改變、MitoSOX熒光檢測間皮細胞內(nèi)線粒體功能改變、電鏡觀察間皮細胞超微結(jié)構(gòu)改變。RT-PCR法檢測腹膜組織內(nèi)TLR

16、9和NLRP3mRNA表達水平。用SPSS19.0和GraphPad6.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果:
　　注射不同劑量LPS后，在6小時腹腔灌洗液中mtDNA水平顯著升高，并且注射LPS劑量越大，mtDNA水平越高。在24小時，mtDNA水平較第6小時均有所下降，但高劑量LPS組mtDNA水平仍顯著高于對照組和低劑量LPS組。并且mtDNA水平與炎癥程度顯著相關，mtDNA濃度越高，IL-1β、IL-6水平和

17、白細胞數(shù)量也越高。同時，注射mtDNA或bDNA6小時后，各組腹膜組織TLR9和NLRP3mRNA表達量上調(diào)，各組腹腔灌洗液中白細胞數(shù)量、IL-1β和IL-6水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，并且這種bDNA或mtDNA劑量呈正相關性。在24小時，腹膜組織TLR9和NLRP3 mRNA表達量較對照組有所下降，各組白細胞數(shù)量、IL-1β和IL-6水平較第6小時下降，但仍顯著高于對照組(P＜0.05);腹膜組織病理改變可見腹膜組織水腫增