玉米芯水解液發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的研究.pdf

1、富馬酸作為一種重要的四碳平臺(tái)化合物，被廣泛應(yīng)用于材料、化工、食品、醫(yī)藥及飼料添加劑等領(lǐng)域，但隨著石油的枯竭和化石資源價(jià)格的攀升，目前以苯為原料工業(yè)化生產(chǎn)富馬酸的途徑將逐步被淘汰。采用天然可再生資源為原料，利用微生物發(fā)酵制備富馬酸，既可以實(shí)現(xiàn)資源替代，更為富馬酸產(chǎn)業(yè)提供了發(fā)展空間。本文采用稀酸、纖維素酶分步水解法將玉米芯轉(zhuǎn)化為還原糖，通過(guò)脫毒技術(shù)處理獲得更為適于微生物生長(zhǎng)代謝的還原糖液;同時(shí)馴化米根霉，并對(duì)其利用不同碳源發(fā)酵產(chǎn)富馬酸能力進(jìn)

2、行考察分析，探究米根霉五、六碳糖共發(fā)酵機(jī)制，構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，提高米根霉利用玉米芯水解液發(fā)酵產(chǎn)富馬酸產(chǎn)量。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)正交試驗(yàn)獲得稀酸預(yù)處理最優(yōu)組合條件:硫酸濃度1.5％、處理時(shí)間60 min、處理溫度120℃、固液比1∶9，水解液總還原糖濃度為46.28±0.45 g/L;纖維素酶水解最佳工藝條件:酶添加量1000 U/g、緩沖液pH4.8、酶解溫度50℃、固液比1∶10、酶解時(shí)間48h

3、，水解液總還原糖濃度為40.38±0.76 g/L;將稀酸和纖維素酶分步處理水解液混合后，還原糖的濃度為43.33±0.62 g/L，其中葡萄糖為30.84±0.38 g/L，木糖為7.46±0.72 g/L，二者比例接近于4∶1;玉米芯水解制備還原糖的轉(zhuǎn)化率為0.35 g/g。
　　(2)玉米芯水解液脫毒處理試驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)量堿中和聯(lián)合活性炭吸附是較好的脫毒方法，其中活性炭吸附的最優(yōu)條件為:活性炭添加量6％、吸附時(shí)間60 min

4、、溫度40℃。此條件下，糠醛脫除率達(dá)到70.71±0.25％，還原糖損失率為14.62±0.38％。
　　(3)經(jīng)過(guò)糠醛濃度梯度選育，獲得糠醛耐受菌株WHT5，該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，對(duì)玉米芯水解液中的發(fā)酵抑制物有較好的耐受性，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其生物量達(dá)到23.07±0.53 g/L，約為原始菌株的3倍，目標(biāo)產(chǎn)物富馬酸產(chǎn)量達(dá)到23.71±0.38 g/L，較原始菌株提高94.66％。
　　(4)響應(yīng)面試驗(yàn)獲得米根霉利用葡萄糖

5、、木糖發(fā)酵產(chǎn)酸的最優(yōu)培養(yǎng)基，富馬酸產(chǎn)量分別為37.18±0.56 g/L和13.28±0.24 g/L;單因素試驗(yàn)得到混合糖和玉米芯水解液發(fā)酵產(chǎn)酸的較適培養(yǎng)基，富馬酸的產(chǎn)量分別為42.18±0.42 g/L和41.20±0.46 g/L。通過(guò)代謝產(chǎn)物和關(guān)鍵酶活性分析，確定了米根霉五、六碳糖共發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的基本代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了代謝通量方程式，并計(jì)算出代謝通量。單因素試驗(yàn)獲得了米根霉預(yù)培養(yǎng)較適pH2.5，以及適于后期發(fā)酵的菌體形態(tài)。發(fā)

6、酵制備富馬酸的較適工藝參數(shù)為:溫度32℃、攪拌速率500 r/min、通氣量0.40 L/min·L，此時(shí)發(fā)酵液中菌體生物量為8.60±0.24 g/L，葡萄糖消耗92.72±0.86 g/L、木糖消耗13.26±0.47 g/L，獲得有機(jī)酸的濃度分別為:富馬酸49.54±0.62 g/L、蘋(píng)果酸17.73±0.38 g/L、琥珀酸1.97±0.15 g/L、乳酸1.40±0.18g/L以及檸檬酸0.50±0.06 g/L，富馬酸產(chǎn)量顯