米根霉富馬酸高產菌株的選育與發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、富馬酸(Fumaric acid)作為一種重要的有機基本化工原料和大宗化工產品，廣泛應用于涂料、樹脂、醫(yī)藥、增塑劑、食品添加劑等領域，具有重要的市場價值。目前工業(yè)上制備富馬酸主要以順酐異構法為主。與其相比，生物法具有原料可持續(xù)供應、操作條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)勢。隨著生物技術的不斷進步和化石資源的日益耗盡，生物法合成富馬酸成為化工行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。米根霉(Rhizopus oryzae)是常用的富馬酸生產菌，本文在誘變得到一株高

2、產富馬酸的米根霉的基礎上，對其種子培養(yǎng)和發(fā)酵產酸的方法進行了探索和優(yōu)化，建立了一套系統有效的發(fā)酵路線，為以后富馬酸的工業(yè)化生產奠定了扎實的基礎。論文主要工作如下：
　　 1.米根霉富馬酸高產菌株的誘變育種
　　 根據代謝調控育種原理，設計了溴甲酚綠與丙烯醇平板的雙初篩標準，建立了一種富馬酸高產菌株的誘變篩選方法。首先，根據致死率、突變率以及篩選結果，確定了紫外、化學誘變的最佳誘變條件分別為：紫外誘變時間1min，誘變孢子

3、液稀釋1000倍；化學誘變劑亞硝酸濃度0.1mol/L，誘變時間10min，誘變孢子液稀釋100倍。在優(yōu)化條件下，通過紫外和化學的復合誘變獲得了一株產量高且穩(wěn)定性好的米根霉突變株ME-F12，產量達到50.39g/L，與原始菌株相比提高23％，連續(xù)傳代5次后，產量無明顯降低，具有較高穩(wěn)定性，其副產物乙醇濃度只有1.87g/L，明顯低于原始菌株。
　　 2.米根霉在5L發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)和形態(tài)控制
　　 在5L發(fā)酵罐水平上對

4、該突變株的種子培養(yǎng)和形態(tài)控制進行了研究，確定了形成菌球的較佳條件為：控制米根霉在發(fā)酵罐內的孢子濃度在5×104-8.3×104/ml的范圍內，攪拌轉速350r/min，pH為2.80，以20g/L的葡萄糖濃度作為最佳種齡的經驗值，判斷最佳種齡為52h。為進一步減少種子培養(yǎng)時間，采用雙階段調控策略控制pH，前8h控制pH為3.50，然后降低至2.80，該條件下最佳種齡縮短至44h，此時可以獲得表面光滑結實的球狀菌體(直徑在1mm左右)。利

5、用該菌球進行發(fā)酵，富馬酸產量達到47.3g/L，轉化率59.1％。
　　 3.米根霉發(fā)酵制備富馬酸的條件優(yōu)化
　　 對發(fā)酵產酸過程的條件和培養(yǎng)基組成進行了優(yōu)化，首先確定基礎的發(fā)酵條件為接種量15％，轉速220r/min，裝液量40ml，發(fā)酵溫度32℃；然后以富馬酸產量和生產速率為目標，利用基于Desirability函數的響應曲面法確定了葡萄糖和尿素的最佳濃度為葡萄糖135g/L、尿素0.06g/L；針對培養(yǎng)基中的金屬離

6、子，采用Plackett-Burman實驗結合響應曲面的方法篩選并優(yōu)化了重要的金屬離子濃度為：KH2PO41.8g/L、MgSO47·H2O1.0g/L、ZnSO4·7H2O0.157g/L、FeSO4·7H2O0.0076g/L、CoCl2·6H2O0.005g/L；最后，根據負反饋調節(jié)原理，考察了添加蘋果酸、乳酸對發(fā)酵過程的影響，確定外源添加0.5g/L乳酸和0.5g/L蘋果酸，提高富馬酸產量的同時能夠抑制副產物的生成。最終富馬酸產