以CaCO3為模板苯丙氨酸解氨酶的固定化及其催化性能的研究.pdf

1、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是酶法生產(chǎn)L-苯丙氨酸(L-Phe)和治療苯丙酮尿癥的關(guān)鍵酶。但是在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，表現(xiàn)出催化效率低、穩(wěn)定性差、難以重復(fù)使用等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了PAL的使用效率。本研究以碳酸鈣為模板，制備出PAL蛋白顆粒和PAL仿生硅雜化蛋白顆粒，并研究了它們的催化性能。
　　1)不同形態(tài)碳酸鈣模板及其固定化酶的初步制備
　　制備不同形態(tài)的碳酸鈣模板，進(jìn)行模板優(yōu)化

2、，并將PAL沉淀交聯(lián)固定到碳酸鈣上，用HCl去除碳酸鈣，獲得不同形態(tài)的蛋白顆粒。結(jié)果表明，以球形碳酸鈣為模板的固定化酶形態(tài)規(guī)則、酶活最高。優(yōu)化后的球形碳酸鈣模板制備條件為:在轉(zhuǎn)速為700 rpm下攪拌2h，用乙二醇∶水=3∶1的溶劑配制濃度為0.7 M的鹽溶液，得到的顆粒分布范圍最窄，均勻度最好，比表面積最大。
　　2)苯丙氨酸解氨酶多孔蛋白顆粒的制備及催化性能的研究
　　以球型碳酸鈣為模板，利用共價(jià)交聯(lián)法制備了球形多孔蛋白

3、顆粒，對(duì)戊二醛濃度和交聯(lián)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳交聯(lián)劑終濃度為0.4％，交聯(lián)時(shí)間為1h。在此條件下，成功制備了大小均一的球形蛋白顆粒，該蛋白顆粒最適催化溫度為50℃，最適催化pH為7.0。蛋白顆粒的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、變性劑耐受性、胰蛋白酶耐受性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性都優(yōu)于游離酶，且蛋白顆粒表現(xiàn)出良好的重復(fù)使用性。動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明，蛋白顆粒的Vmax低于游離酶，Km高于游離酶，說(shuō)明蛋白顆粒與底物接觸的傳質(zhì)阻力大于游離酶，與底物親和力低于游離

4、酶。
　　3) PAL仿生硅雜化蛋白顆粒的制備及其催化性能的研究
　　分別制備了包埋有多孔蛋白顆粒的實(shí)心球形仿生硅化蛋白顆粒和核殼結(jié)構(gòu)仿生硅化蛋白顆粒，并分別研究了它們的催化性能。核殼結(jié)構(gòu)仿生硅化蛋白顆粒的優(yōu)化制備條件為:將雜化后蛋白顆粒分散在2.2 mL Tris-HCl緩沖液中，十二烷基三甲基溴化銨(CTAB)最佳添加量為300μL，四甲氧基硅烷(TMOS)的最佳添加量為20μL。最終成功制備了兩種仿生硅化蛋白顆粒，實(shí)心