丹參苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL1）的克隆及其功能初探.pdf

1、丹參．Salvia miltiorrhiza Bunge是一種著名的藥用植物，在中國(guó)境內(nèi)廣為種植。作為傳統(tǒng)中藥之一，丹參的根(也稱為“丹參”)在中國(guó)、美國(guó)、日本等地區(qū)被廣泛應(yīng)用于心腦血管、月經(jīng)不調(diào)以及各種炎癥等疾病的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參的活性物質(zhì)分為兩大類：一類為脂溶性的丹參酮類化合物，包括丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA等；另一類為水溶性的酚酸類物質(zhì)，包括迷迭香酸、丹酚酸、紫草酸以及丹參素等。鑒于傳統(tǒng)中醫(yī)以水煎服的用藥方法，以及水溶性成

2、分的顯著藥理活性，丹參水溶性酚酸類物質(zhì)已成為目前研究的熱點(diǎn)。已有實(shí)驗(yàn)表明，苯丙烷類代謝途徑的中間產(chǎn)物如咖啡酸等參與丹參水溶性物質(zhì)的合成。本論文以苯丙烷類代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶——苯丙氨酸解氨酶(PAL)為研究對(duì)象，進(jìn)行基因克隆，并采用RNAi的手段對(duì)該基因的功能進(jìn)行研究，初步探討了苯丙氨酸解氨酶基因與丹參生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝物合成之間的關(guān)系，為闡明丹參主要水溶性成分合成的分子機(jī)理提供資料，同時(shí)也為進(jìn)一步利用基因工程改良丹參品質(zhì)、提高丹參有

3、效成分含量奠定基礎(chǔ)。主要研究方法與結(jié)果如下： 1．利用DNA Walking的方法從DNA水平克隆獲得了一條丹參苯丙氨酸解氨酶基因(SmPALl)的全長(zhǎng)，Genebank注冊(cè)號(hào)為：EF462460。該基因全長(zhǎng)2758 bp，由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子(622 bp)組成，內(nèi)含子插入的位置與其它物種一致，且兩端具有內(nèi)含子的保守序列GT/AG。同源性分析結(jié)果顯示SmPAL1基因與其它物種中已報(bào)道的PAL基因之間同源性高達(dá)80％以上。S

4、outhern雜交結(jié)果顯示丹參苯丙氨酸解氨酶基因是一個(gè)多基因家族，至少含有兩個(gè)不同的家族成員。 2．克隆獲得了約為1.0 kb的．SmPAL1基因5’側(cè)翼序列，并對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及TATA box等序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示該區(qū)域含有植物苯丙烷類代謝途徑啟動(dòng)子區(qū)的保守元件box1、box2，以及G box、w box、Ibox、MYB recognition site、 ABA responsive element like se

5、quence等順式作用元件。在此基礎(chǔ)上，利用Real-time PCR技術(shù)分析了SmPAL1基因在不同部位以及不同脅迫條件下的表達(dá)情況。該基因在丹參的根、莖、葉中均有表達(dá)，其中以葉中表達(dá)量最高。苯丙氨酸解氨酶是誘導(dǎo)酶，多種環(huán)境因素均可影響SmPAL1基因的表達(dá)，其中ABA、損傷、脫水可誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，而黑暗則抑制SmPAL1基因的表達(dá)，低溫對(duì)該基因的影響不明顯。 3．構(gòu)建了SmPAL1基因的原核表達(dá)載體，并在Escherich

6、ia coli M15菌株中進(jìn)行了表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示，重組蛋白分子量約為77 kDa，與預(yù)測(cè)的該基因編碼產(chǎn)物的分子量相吻合。酶活性檢測(cè)顯示重組蛋白具有較高的苯丙氨酸解氨酶活性，其發(fā)揮作用的最適溫度為60℃，在硼酸緩沖液中的最適pH為8.7。 4.選取SmPAL1基因3'端一段長(zhǎng)為217bp的片段作為靶片段，構(gòu)建RNAi載體 pSmPAL1。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化丹參，經(jīng)50mg/l卡那霉素篩選以及 PCR檢測(cè)

7、獲得了25株陽(yáng)性RNAi株系，轉(zhuǎn)化效率為69.4％。進(jìn)一步分析顯示，RNAi植株中SmPAL1基因的表達(dá)量均明顯下降，而丹參苯丙氨酸解氨酶基因家族的另一成員SmPAL2基因的表達(dá)情況則因植株而異。 5.對(duì)陽(yáng)性RNAi植株的表型進(jìn)行了觀察，與對(duì)照植株相比，RNAi植株表現(xiàn)出矮小、生根時(shí)間延緩以及葉和莖的表面出現(xiàn)壞死斑等異常表型，一些植株在培養(yǎng)過程中死亡。此外，用間苯三酚對(duì)RNAi植株的莖切片進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)RNAi植株中木質(zhì)素的含量