丹參苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL1）的克隆及其功能初探.pdf

1、丹參．Salvia miltiorrhiza Bunge是一種著名的藥用植物，在中國境內(nèi)廣為種植。作為傳統(tǒng)中藥之一，丹參的根(也稱為“丹參”)在中國、美國、日本等地區(qū)被廣泛應用于心腦血管、月經(jīng)不調(diào)以及各種炎癥等疾病的治療?，F(xiàn)代藥理學研究表明，丹參的活性物質(zhì)分為兩大類：一類為脂溶性的丹參酮類化合物，包括丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA等；另一類為水溶性的酚酸類物質(zhì)，包括迷迭香酸、丹酚酸、紫草酸以及丹參素等。鑒于傳統(tǒng)中醫(yī)以水煎服的用藥方法，以及水溶性成

2、分的顯著藥理活性，丹參水溶性酚酸類物質(zhì)已成為目前研究的熱點。已有實驗表明，苯丙烷類代謝途徑的中間產(chǎn)物如咖啡酸等參與丹參水溶性物質(zhì)的合成。本論文以苯丙烷類代謝途徑的第一個關鍵酶——苯丙氨酸解氨酶(PAL)為研究對象，進行基因克隆，并采用RNAi的手段對該基因的功能進行研究，初步探討了苯丙氨酸解氨酶基因與丹參生長發(fā)育及次生代謝物合成之間的關系，為闡明丹參主要水溶性成分合成的分子機理提供資料，同時也為進一步利用基因工程改良丹參品質(zhì)、提高丹參有

3、效成分含量奠定基礎。主要研究方法與結果如下： 1．利用DNA Walking的方法從DNA水平克隆獲得了一條丹參苯丙氨酸解氨酶基因(SmPALl)的全長，Genebank注冊號為：EF462460。該基因全長2758 bp，由兩個外顯子和一個內(nèi)含子(622 bp)組成，內(nèi)含子插入的位置與其它物種一致，且兩端具有內(nèi)含子的保守序列GT/AG。同源性分析結果顯示SmPAL1基因與其它物種中已報道的PAL基因之間同源性高達80％以上。S

4、outhern雜交結果顯示丹參苯丙氨酸解氨酶基因是一個多基因家族，至少含有兩個不同的家族成員。 2．克隆獲得了約為1.0 kb的．SmPAL1基因5’側(cè)翼序列，并對轉(zhuǎn)錄起始位點以及TATA box等序列進行了預測。結果顯示該區(qū)域含有植物苯丙烷類代謝途徑啟動子區(qū)的保守元件box1、box2，以及G box、w box、Ibox、MYB recognition site、 ABA responsive element like se

5、quence等順式作用元件。在此基礎上，利用Real-time PCR技術分析了SmPAL1基因在不同部位以及不同脅迫條件下的表達情況。該基因在丹參的根、莖、葉中均有表達，其中以葉中表達量最高。苯丙氨酸解氨酶是誘導酶，多種環(huán)境因素均可影響SmPAL1基因的表達，其中ABA、損傷、脫水可誘導該基因的表達，而黑暗則抑制SmPAL1基因的表達，低溫對該基因的影響不明顯。 3．構建了SmPAL1基因的原核表達載體，并在Escherich

6、ia coli M15菌株中進行了表達。SDS-PAGE分析顯示，重組蛋白分子量約為77 kDa，與預測的該基因編碼產(chǎn)物的分子量相吻合。酶活性檢測顯示重組蛋白具有較高的苯丙氨酸解氨酶活性，其發(fā)揮作用的最適溫度為60℃，在硼酸緩沖液中的最適pH為8.7。 4.選取SmPAL1基因3'端一段長為217bp的片段作為靶片段，構建RNAi載體 pSmPAL1。利用農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化丹參，經(jīng)50mg/l卡那霉素篩選以及 PCR檢測

7、獲得了25株陽性RNAi株系，轉(zhuǎn)化效率為69.4％。進一步分析顯示，RNAi植株中SmPAL1基因的表達量均明顯下降，而丹參苯丙氨酸解氨酶基因家族的另一成員SmPAL2基因的表達情況則因植株而異。 5.對陽性RNAi植株的表型進行了觀察，與對照植株相比，RNAi植株表現(xiàn)出矮小、生根時間延緩以及葉和莖的表面出現(xiàn)壞死斑等異常表型，一些植株在培養(yǎng)過程中死亡。此外，用間苯三酚對RNAi植株的莖切片進行染色，發(fā)現(xiàn)RNAi植株中木質(zhì)素的含量