酶法合成甘露糖-6-磷酸.pdf

1、甘露糖-6-磷酸(Mannose-6-phosphate，M6P)是人體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾的重要磷酸化合物，在醫(yī)療領(lǐng)域以及化妝品領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。酶催化相比于化學法具有專一性強和安全環(huán)保等優(yōu)勢，但催化反應(yīng)所需ATP以及激酶使得生產(chǎn)成本較高。本論文主要目的是開發(fā)一種酶催化合成甘露糖-6-磷酸的新方法，在大腸桿菌中異源表達一種依賴多聚磷酸鹽型甘露糖激酶，該酶能夠利用多聚磷酸鹽代替價格昂貴的ATP催化合成甘露糖-6-磷酸。論文的研究內(nèi)容包括基因

2、工程菌構(gòu)建、酶學基本性質(zhì)研究、蛋白表達條件優(yōu)化、反應(yīng)條件優(yōu)化幾個方面，具體工作與研究結(jié)果如下:
　　(1)克隆了來自節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.KM）和分枝桿菌(Mycobacterium sp.MCS)的多聚磷酸鹽依賴型甘露糖激酶基因，并構(gòu)建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-l7/pET28a-mp)，提取胞內(nèi)酶以多聚磷酸鹽為磷酸供體進行甘露糖-6-磷酸的合成。
　　(2)對分枝桿菌（

3、Mycobacterium sp.MCS）中的多聚磷酸鹽依賴型甘露糖激酶MP的酶學基本性質(zhì)進行研究，MP最適溫度25℃，最適pH為8.5，最適磷酸供體為六偏磷酸鈉，輔因子Mg2+的最適添加濃度為5mM，MP對葡萄糖以及甘露糖的Km值分別為9.57 mM、203.65mM，對ATP以及六偏磷酸鈉的Km值為4.62 mM、1.7 mM。
　　(3)對節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.KM）中的多聚磷酸鹽依賴型甘露糖激酶L7蛋白表

4、達條件進行優(yōu)化。使用TB培養(yǎng)基，28℃，0.2 mM IPTG誘導(dǎo)12小時后可使蛋白表達量提高3倍，單位體積發(fā)酵液產(chǎn)酶活量提高4.7倍，高密度發(fā)酵中3L發(fā)酵產(chǎn)酶共2.25×106U。
　　(4)對節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.KM）中的多聚磷酸鹽依賴型甘露糖激酶L7的反應(yīng)條件進行優(yōu)化。當甘露糖與六偏磷酸鈉摩爾比為1∶3，酶液濃度0∶356 mg· mL-1，30℃，pH8.5的條件下反應(yīng)3h后，甘露糖轉(zhuǎn)化率可達到99.8