櫟精對(duì)葡萄糖-6-磷酸酶基因表達(dá)和活性的影響.pdf

1、目的：葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-Pase)是糖代謝過(guò)程中一個(gè)重要的酶，由于它是糖異生和糖原分解的最后一步反應(yīng)的限速酶，因此其基因表達(dá)水平及活性的變化直接影響到內(nèi)生性糖的輸出。事實(shí)上，2型糖尿病的高血糖同肝臟胰島素抵抗所致肝糖過(guò)度輸出有著緊密的關(guān)系。因此G-6-Pase是糖尿病治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究櫟精，G-6-Pase的一種新型抑制劑，對(duì)該酶基因表達(dá)和活性的影響，為進(jìn)一步探討利用

2、該酶的抑制劑作為糖尿病的治療手段提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：以膠原酶原位灌注消化的方法分離大鼠肝細(xì)胞，用含10％FBS的1640培養(yǎng)液進(jìn)行原代培養(yǎng)，利用抗大鼠CK-18作為一抗，采用免疫組化方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。待細(xì)胞貼壁換用新鮮的含誘導(dǎo)劑和不同濃度抑制劑的培養(yǎng)液培養(yǎng)16小時(shí)后：1)提取細(xì)胞總RNA，采用半定量RT-PCR的方法測(cè)定G-6-pase兩個(gè)亞基的mRNA的豐度；2)利用葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)測(cè)定酶的活性。 結(jié)

3、果：1.采用以膠原酶原位灌注消化的方法分離的肝細(xì)胞產(chǎn)率及活率均比較高。細(xì)胞活率可達(dá)到85％以上。 2.免疫組化染色結(jié)果呈陽(yáng)性著色(有陰性對(duì)照)。 3.大鼠肝細(xì)胞在高糖培養(yǎng)液(25mMGlu)中培養(yǎng)16小時(shí)后，G-6-Pase催化亞基和轉(zhuǎn)運(yùn)亞基mRNA的豐度和酶活性均明顯增加。(P＜0.05)4.加入不同濃度的櫟精與高糖聯(lián)合培養(yǎng)16小時(shí)后，G-6-Pase的兩個(gè)亞基的mRNA的豐度均下降(P＜0.05)，但沒(méi)有呈現(xiàn)劑量依賴(lài)

4、性的變化。 5.酶活性測(cè)定的結(jié)果與基因水平的結(jié)果相一致，加入櫟精后，酶活性下降(P＜0.05)。 結(jié)論：利用膠原酶消化分離的肝細(xì)胞具有良好的產(chǎn)率及活率。原代肝細(xì)胞在高糖(25mM)狀態(tài)下培養(yǎng)，G-6-Pase的兩個(gè)主要的組成部分P36和P46均出現(xiàn)不同程度的高表達(dá)，這與最初的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相吻合，成功的模擬了體內(nèi)的高糖環(huán)境所產(chǎn)生的影響。不同濃度的櫟精可抑制高糖狀態(tài)下P36和P46的基因轉(zhuǎn)錄，但不同劑量組之間并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這