重組人肝活素(HPS)的受體分離和確認(rèn)研究.pdf

1、肝活素（ hepassocin， HPS），又名肝細(xì)胞衍生纖維蛋白原相關(guān)蛋白1（Hepatocyte-derived Fibrinogen-Related Protein1）或類纖維蛋白原1（Fibrinogen-Like1,FGL1），是一種肝臟特異性的促有絲分裂因子，并在肝部分切除、四氯化碳（CCl4）、D-氨基半乳糖（D-galN）等誘導(dǎo)的肝損傷修復(fù)中起重要作用。我們前期的研究表明HPS以表皮生長因子受體（EGFR）依賴方式激活M

2、APK信號通路并介導(dǎo)促進(jìn)正常肝細(xì)胞增殖作用，但有關(guān)是否存在HPS特異受體及其受體分子還知之甚少。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期通過CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備重組HPS的基礎(chǔ)上，建立了重組人HPS體外生物學(xué)活性測定方法，證實(shí)獲得高活性的重組HPS。進(jìn)而采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)和受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)肝源細(xì)胞存在HPS特異受體。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)ANXA2分子是HPS受體候選分子，進(jìn)一步我們通過多種方法證實(shí)ANXA2分子參與HPS膜信號的傳遞，表明ANXA2分子

3、至少是 HPS受體成分之一。這些研究結(jié)果為研究HPS介導(dǎo)的信號途徑及其在嚴(yán)重肝病治療中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。
　　前期實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建了CHO-HPS表達(dá)細(xì)胞系，并獲得多批次HPS樣品，本研究驗(yàn)證了重組HPS的理化性質(zhì)和純度，證實(shí)獲得高純度 HPS。進(jìn)一步，我們通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立了基于EdU摻入的促肝細(xì)胞增殖及基于乳酸脫氫酶釋放的肝細(xì)胞保護(hù)兩種體外HPS生物活性檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組HPS以劑量依賴方式促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，抑制CC

4、l4誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶釋放，表明我們獲得了高純度高活性的重組HPS，可用于HPS受體及其信號途徑和 HPS功能等研究。這兩種方法操作簡單、重復(fù)性好，較好地反映了HPS體內(nèi)通過促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、抑制肝細(xì)胞壞死救治急性肝損傷小鼠的活性，可用于重組HPS體外生物學(xué)活性的評價(jià)，為重組HPS質(zhì)量控制和研究HPS的功能奠定基礎(chǔ)。為證實(shí)細(xì)胞膜上是否存在HPS特異受體，我們首先采用FITC熒光標(biāo)記HPS，并通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察HPS是否能與肝細(xì)胞膜結(jié)合，結(jié)

5、果發(fā)現(xiàn)FITC標(biāo)記的HPS可特異結(jié)合在L02肝細(xì)胞膜部位，提示L02細(xì)胞存在HPS特異結(jié)合受體。為驗(yàn)證這一結(jié)果，我們采用經(jīng)典的碘標(biāo)法標(biāo)記HPS,體外生物活性檢測表明125I-標(biāo)記的HPS保持了促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的活性，提示I-標(biāo)記沒有破壞HPS的空間結(jié)構(gòu)。受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPS與L02人肝細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞及小鼠原代肝細(xì)胞的結(jié)合呈現(xiàn)典型的受體與配體的結(jié)合動力學(xué)方式，L02細(xì)胞的飽和濃度為1546.32ng/mL，HepG2細(xì)胞的

6、飽和濃度為2753.84ng/mL，小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的飽和濃度為2242.76ng/mL。L02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、小鼠原代肝細(xì)胞表面HPS受體數(shù)目分別為3.1×105sites/cell、1.8×105sites/cell和4.8×105sites/cell。小鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受體數(shù)量較多，可能與該細(xì)胞體積比較大有關(guān)。Scatchard分析結(jié)果顯示，三種肝源細(xì)胞只存在一種HPS受體。HPS與L02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、小鼠原代肝細(xì)胞的

7、結(jié)合常數(shù)依次為6.71pmol/L、7.7nmol/L和2.17nmol/L。競爭實(shí)驗(yàn)表明，高倍濃度非標(biāo)的HPS能夠有效競爭125I-HPS與細(xì)胞的結(jié)合，符合受體配體間的競爭曲線。這些結(jié)果表明上述肝源細(xì)胞存在 HPS特異膜受體。檢測125I-HPS與非肝源細(xì)胞A549、Hela、EA926細(xì)胞的結(jié)合發(fā)現(xiàn)，HPS與受體的結(jié)合具有肝特異性。用高濃度EGF、HGF不能競爭HPS與肝細(xì)胞的結(jié)合，說明HPS受體不同于EGF和HGF受體。進(jìn)一步，我

8、們用配體與受體交聯(lián)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)HPS特異受體的存在。放射自顯影結(jié)果表明125I-HPS與受體形成的復(fù)合體大小約為110kD，已知HPS的單體去除 N端信號肽后分子量為34kD，二聚體是其發(fā)揮活性的構(gòu)象，分子量大小為68kD，因此推測HPS受體的分子量約為42kD。
　　為確認(rèn)HPS的受體分子，我們采用蛋白質(zhì)組技術(shù)鑒定了HPS刺激后細(xì)胞膜蛋白質(zhì)磷酸化的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPS刺激L02細(xì)胞顯著誘導(dǎo)40kD左右的酪氨酸磷酸化蛋白帶，對這一條

9、帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，得到4個(gè)候選蛋白，通過對候選蛋白質(zhì)組織分布、細(xì)胞定位、功能分析等綜合判斷，我們推測ANXA2分子可能為HPS的受體。進(jìn)一步，我們驗(yàn)證了HPS可誘導(dǎo)ANXA2發(fā)生酪氨酸磷酸化，HPS可與ANXA2在細(xì)胞膜共定位并發(fā)生相互作用；采用RNA干涉下調(diào)ANXA2表達(dá)，顯著降低125I-HPS與L02細(xì)胞的結(jié)合；下調(diào)ANXA2表達(dá)抑制了HPS誘導(dǎo)的EGFR磷酸化和MAPK通路的活化，并抑制了HPS促進(jìn)L02細(xì)胞增殖和降低CCl4誘導(dǎo)

10、肝細(xì)胞損傷的活性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ANXA2是HPS信號通路的關(guān)鍵分子，參與了HPS與肝源細(xì)胞的結(jié)合過程，是HPS受體或者至少是HPS受體的組成部分。
　　我們還通過同源建模的方法建立了HPS的三維結(jié)構(gòu)，通過對模型進(jìn)行優(yōu)化，最終建立了一個(gè)高質(zhì)量的HPS三維結(jié)構(gòu)模型。將此模型與ANXA2進(jìn)行剛性對接，并結(jié)合構(gòu)型進(jìn)行多重優(yōu)化，獲得HPS與ANXA2最佳的結(jié)合構(gòu)型。ANXA2與HPS相互作用的殘基為：PHE72、GLN69、MET11。

11、與之對應(yīng)的HPS作用的殘基為：Glu59、Leu55、Lys65。
　　HPS受體的確認(rèn)對闡明HPS信號通路、功能及在嚴(yán)重肝病治療中的作用等多個(gè)方面具有重要意義，同時(shí)，HPS受體也可能成為肝臟疾病的靶點(diǎn)，用于新藥的研發(fā)。雖然本實(shí)驗(yàn)初步確認(rèn)ANXA2參與HPS與細(xì)胞結(jié)合的過程，但ANXA2缺乏嚴(yán)格的肝組織特異性，不能從組織分布的角度解釋 HPS特異促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，此外，我們前期的研究表明HPS刺激肝細(xì)胞增殖依賴于EGFR的