炎癥反應(yīng)在撲熱息痛肝損害中的作用和重組人白細(xì)胞介素-11對(duì)撲熱息痛肝損害的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：撲熱息痛(Acetaminophen，AAP)是目前世界上廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛藥，過(guò)量使用將導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損害。在正常情況下，健康成人口服治療劑量的AAP，90％以上通過(guò)與葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合由尿排泄，僅有不到5％的AAP由細(xì)胞色素P-450系統(tǒng)代謝成親電子的毒性中間代謝產(chǎn)物乙酰苯醌亞胺(N-acetyl-P-benzoquinoneimine，NAPQI)，NAPQI通過(guò)與谷胱甘肽結(jié)合迅速被清除。但在AAP過(guò)量的情況下，可導(dǎo)致葡萄糖

2、醛酸化和硫酸化道路飽和，大量的AAP轉(zhuǎn)由細(xì)胞色素P-450系統(tǒng)氧化，結(jié)果導(dǎo)致谷胱甘肽儲(chǔ)備的耗竭，并剩下多余的不能與谷胱甘肽結(jié)合的NAPQI。NAPQI與肝細(xì)胞的蛋白共價(jià)結(jié)合，產(chǎn)生肝毒性。近來(lái)，炎癥反應(yīng)在AAP肝損害中的作用引起人們的重視。AAP引起的損傷可以激活肝枯否氏細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生各種促炎因子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在肝臟的侵潤(rùn)和激活，使炎癥反應(yīng)持續(xù)和放大，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激和過(guò)氧化亞硝酸鹽形成，對(duì)肝損傷起了重要的放大

3、和促進(jìn)作用。TrepicchioWL等報(bào)道：用重組人白細(xì)胞介素-11(Recombinanthumaninterleukin-11，rhIL-11)預(yù)處理小鼠可以減輕AAP引起的炎癥反應(yīng)，同時(shí)伴隨著小鼠肝臟損傷的減輕，提示rhIL-11可能具有減輕AAP肝損害的作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康模航⒋笫驛AP肝損害模型；探討炎癥反應(yīng)在大鼠AAP肝損害中的作用；探討rhIL-11對(duì)大鼠AAP肝損害的影響及其機(jī)制。 方法1實(shí)驗(yàn)分組和處理：80只雌性

4、SD大鼠，隨機(jī)分為4個(gè)大組和16小組。4個(gè)大組分別為：空白對(duì)照組、AAP組、rhIL-11組、AAP+rhIL-11組。各大組按照動(dòng)物處死不同時(shí)間點(diǎn)(3h、6h、12h、24h)分為4個(gè)小組，每小組5只大鼠。各組處理如下： 對(duì)照組：先給予無(wú)菌注射用水皮下注射，2小時(shí)后給予PBS液腹腔注射； AAP組：先給予無(wú)菌注射用水皮下注射，2小時(shí)后給予AAP(1g/kg)腹腔注射。 rhIL-11組：先給予rhIL-11(1

5、mg/kg)皮下注射，2小時(shí)后給予PBS液腹腔注射。 AAP+rhIL-11組：先給予rhIL-11皮下注射，2小時(shí)后給予AAP腹腔注射。 腹腔注射后3、6、12、24h各大組分別用10％水合氯醛腹腔注射麻醉1小組大鼠，心臟穿刺取血，分離血清，-20℃保存；于肝臟中葉取2塊肝組織，分別置于10％甲醛、2.5％戊二醛中固定。后立即取下余下肝組織，置于液氮中，-80℃保存。 2檢測(cè)指標(biāo)和方法測(cè)定血清ALT水平，HE染

6、色觀察肝臟病理改變，原位末端標(biāo)記(TdT-mediateddUTP-biotinnickendlabeling，TUNEL)法和透射電鏡檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡，放免法測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α(Tumournecrosisfactor-α，TNF-α)水平，免疫組化方法測(cè)定肝組織TNF-α、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(Induciblenitricoxidesynthase，iNOS)表達(dá)，Western-blot方法檢測(cè)肝組織TNF-α、iNOS蛋白的

7、表達(dá)，RT-PCR的方法檢測(cè)肝組織細(xì)胞間黏附分子1(Intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子1(Cytokine-inducedneutrophilchemoattractant-1，CINC-1)、白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果1.血清ALT水平變化：AAP組較對(duì)照組顯著升高(p＜0.01)，24h達(dá)高峰

8、。AAP+rhIL-11組較AAP組顯著降低(3h、6h、12hP＜0.05，24hP＜0.01)，但仍顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)。對(duì)照組和rhIL-11組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 2.肝組織病理學(xué)變化：AAP組肝臟明顯腫大、充血，鏡下：輕者表現(xiàn)為肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死、重者表現(xiàn)為小葉中心肝細(xì)胞廣泛的帶狀壞死，隨時(shí)間進(jìn)行性加重，24h達(dá)高峰。AAP+rhIL-11組病理?yè)p傷較AAP組明顯減輕(兩組間壞死面積％比較，12hP＜

9、0.05，24hP＜0.01；余時(shí)間點(diǎn)兩組間無(wú)顯著性差異，P＞0.05)。對(duì)照組和rhIL-11組未見異常。 3.肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptosisindex，AI)：對(duì)照組和rhIL-11組罕見凋亡肝細(xì)胞。AAP組中央靜脈周圍可見大量凋亡細(xì)胞，12h達(dá)高峰，AI顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。AAP+rhIL-11組AI較AAP組顯著降低(12hP＜0.05，24hP＜0.01；余時(shí)間點(diǎn)兩組間無(wú)顯著性差異，P＞0.05)，但仍

10、顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)。 4.肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察：對(duì)照組和rhIL-11組基本正常。AAP組可見明顯的肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，12h最易找到。AAP+rhIL-11組偶見肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。 5.血清TNF-α水平變化：24h，AAP組顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.01)，與血清ALT水平呈顯著的正相關(guān)(r=0.773，P＜0.01)，AAP+rhIL-11組較AAP組顯著降低(P＜0.01)，但仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.05

11、)，對(duì)照組和rhIL-11組間無(wú)顯著差別(P＞0.05)。余時(shí)間點(diǎn)各組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 6.免疫組化方法測(cè)定肝組織TNF-α、iNOS表達(dá)：對(duì)照組和rhIL-11組僅有中央靜脈周圍少量肝細(xì)胞表達(dá)，著色淺、范圍??；AAP組表達(dá)部位主要在中央靜脈周圍和匯管區(qū)周圍的大量肝細(xì)胞和少量肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞，著色深，范圍廣，兩者分別于6h、12h達(dá)高峰。AAP+rhIL-11組表達(dá)部位與AAP組大致相同，但表達(dá)強(qiáng)度顯著降

12、低，但仍顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P＜0.01)。 7.Western-blot方法檢測(cè)肝組織TNF-α、iNOS蛋白的表達(dá)：AAP組表達(dá)顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)，分別于3h、6h達(dá)高峰，24h時(shí)仍高于正常水平。AAP+rhIL-11組表達(dá)較AAP組顯著降低，但仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，對(duì)照組和rhIL-11組間無(wú)顯著差別(P＞0.05)。 8.肝組織ICAM-1、CINC-1、IL-10mRNA的表達(dá)ICAM-1、

13、CINC-1mRNA表達(dá)：AAP組表達(dá)顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)，分別于3h、6h達(dá)高峰，24h時(shí)仍高于正常水平。AAP+rhIL-11組表達(dá)較AAP組顯著降低，但仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，對(duì)照組和rhIL-11組間無(wú)顯著差別(P＞0.05)。 IL-10mRNA表達(dá)：AAP組表達(dá)顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)，于12h達(dá)高峰，24h時(shí)仍高于正常水平。AAP+rhIL-11組表達(dá)與AAP組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

14、對(duì)照組和rhIL-11組間無(wú)顯著差別(P＞0.05)。 結(jié)論1.給予SD大鼠AAP(1g/kg)腹腔注射，可成功制造出AAP肝損害動(dòng)物模型。 2.AAP肝損害過(guò)程中同時(shí)存在肝細(xì)胞壞死和凋亡，早期以凋亡為主，后期以壞死為主。 3.促炎因子TNF-α、iNOS、CINC-1、ICAM-1在AAP肝損害的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，說(shuō)明炎癥反應(yīng)在AAP肝損害中占有重要地位。 4.IL-10抑制上述促炎因子