基于木質(zhì)纖維素生物煉制廢物的微生物油脂生產(chǎn)及其機理研究.pdf

1、化石資源的大量消耗以及隨之而來的環(huán)境污染問題使得研究新的可再生清潔能源成為當(dāng)務(wù)之急。生物柴油被認為是優(yōu)質(zhì)的石化燃料替代品。目前普遍使用的生物柴油原料，如植物油脂和餐飲廢棄油脂等，已難以滿足日益擴大的生物柴油市場需求。微生物油脂以其獨特的優(yōu)勢（例如生產(chǎn)周期較短，不受限于地理環(huán)境和季節(jié)）被逐漸應(yīng)用于能源領(lǐng)域，成為生物柴油生產(chǎn)的發(fā)展趨勢之一。而尋找廉價的碳源培養(yǎng)基以降低其生產(chǎn)成本是大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用微生物油脂的關(guān)鍵。木質(zhì)纖維素原料在生物煉制過程

2、中可產(chǎn)生多種含碳廢物。鑒于產(chǎn)油微生物對碳源利用的廣譜性，本文采用渾濁紅球菌（Rhodococcus opacus）PD630及DSM1069作為產(chǎn)油功能菌，考察了熱解輕油、生物乙醇生產(chǎn)預(yù)處理廢液，以及制漿造紙黑液堿木質(zhì)素等木質(zhì)纖維素生物煉制廢物作為潛在的油脂生產(chǎn)原料的可行性，并通過凝膠滲透色譜(GPC)、核磁共振(NMR)、掃描電子顯微鏡(SEM)等檢測手段初步探討了其中的作用機理，旨在為微生物油脂應(yīng)用于生物柴油提供新的碳源途徑，同時為

3、推動木質(zhì)纖維素廢物的資源化利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本文具體的研究工作和主要成果歸納如下。
　　首先，論文探索這兩種菌在熱解輕油培養(yǎng)基中的生長及油脂積累情況。實驗中設(shè)置了兩組不同的pH值。研究證明細菌在酸性(pH=4)及中性(pH=7)條件下均可進行細胞增殖，且在一定范圍內(nèi)細菌生物量隨著底物濃度的升高而增大。擴大實驗數(shù)據(jù)表明，將適應(yīng)后的菌體轉(zhuǎn)移至氮源缺乏的輕油培養(yǎng)基后均生長良好。其中酸性條件下菌體增殖更快，PD630和DSM10

4、69的最大生物量分別可達到0.82及0.90g/L，相比于pH=7的基質(zhì)分別增長了10.81和9.76％，且兩種細菌的油脂含量最大值均出現(xiàn)在16h，分別占細菌干重的25.8和22.0％。另外酸性條件下DSM1069的脂肪酸主要為飽和脂肪酸，隨著外界環(huán)境pH值增大到7，胞內(nèi)飽和脂肪酸合成減少，不飽和脂肪酸含量增加。而PD630在兩種pH值條件下均大量積累飽和脂肪酸，尤其在pH值為7時，飽和脂肪酸的比例遠遠大于不飽和脂肪酸。31P NMR及

5、13C NMR分析表明發(fā)酵過程中，細菌主要攻擊脂肪鏈類物質(zhì)，同時芳香族化合物單體及二聚體也發(fā)生相應(yīng)減少。
　　不同木質(zhì)纖維素生物質(zhì)預(yù)處理廢液中也含有糖類及木質(zhì)素衍生物等多種有機物。本實驗以熱水預(yù)處理及有機溶劑預(yù)處理廢液為研究對象，預(yù)實驗首先分別考察了PD630及DSM1069在葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖五種單糖不同濃度溶液下的生長情況，發(fā)現(xiàn)細菌主要利用六碳糖進行細胞代謝，且菌體增長隨著單糖濃度的增大而增大。其中PD63

6、0可利用葡萄糖、甘露糖和半乳糖，而DSM1069只能消耗前兩種糖類。熱水預(yù)處理廢液直接作為培養(yǎng)基質(zhì)時造成細菌大量死亡，表明預(yù)處理過程生成的HMF、呋喃甲醛等副產(chǎn)物嚴重抑制了細菌的生理活動。石灰法聯(lián)合非離子型樹脂吸附法可有效去除廢液中的副產(chǎn)物。去毒后，火炬松預(yù)處理廢液(DPAH)中R.opacus PD630和DSM1069細菌生物量均在72 h達到最大，分別為0.96 g/L、1.03 g/L，而楓香樹預(yù)處理廢液(DSAH)中細菌的生長

7、延滯期較長，其達到的最大生物量分別為1.18 g/L(PD630)及1.06 g/L(DSM1069)。另外，DSAH培養(yǎng)基中PD630菌體含油量最大可達到28.6％，油脂產(chǎn)量為0.25 g/L。而DSM1069可在DPAH為碳源時達到產(chǎn)油水平，其最大油脂含量及油脂產(chǎn)量分別為為28.3％、0.31 g/L。有機溶劑預(yù)處理廢液中除了溶出的半纖維素衍生糖類之外，還含有木質(zhì)素降解的芳香環(huán)衍生物。實驗結(jié)果表明，R.opacus DSM1069可

8、同時利用乙醇預(yù)處理廢液中的糖類（主要為葡萄糖）和芳香環(huán)化合物，并將其轉(zhuǎn)化為菌體油脂。其最大油脂含量出現(xiàn)在48 h，油脂含量為26.88％。發(fā)酵前及48 h的油脂成分主要為偶數(shù)碳鏈的脂肪酸，包括棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)及油酸(C18∶1)。
　　接著，本研究考察了R.opacus DSM1069對黑液提取堿木質(zhì)素(BL-Kraft lignin)及商業(yè)堿木質(zhì)素的降解。研究發(fā)現(xiàn)，以BL-Kraft lignin為碳源

9、時，所得菌體最大油脂含量僅為6％。GPC、13C NMR及HSQC-NMR等分析手段表明細菌主要利用堿木質(zhì)素中高含量的小分子抽提物進行細胞增殖。為提高油脂產(chǎn)量及木質(zhì)素轉(zhuǎn)化率，實驗進一步引入氧降解處理方法對堿木質(zhì)素進行預(yù)處理（O2-Kraft lignin）。以商用堿木質(zhì)素（其木質(zhì)素含量為88.11％，抽提物及糖類含量極少）為研究對象。結(jié)果表明，未處理的堿木質(zhì)素(Untreated-Kraft lignin)和氧降解處理強度不足的堿木質(zhì)素

10、（O2-Kraft lignin-A）均難以維持細菌生長。當(dāng)增加預(yù)處理強度（預(yù)處理B）時，堿木質(zhì)素大分子結(jié)構(gòu)斷裂，分子量明顯減小。細菌在O2-Kraft lignin-B培養(yǎng)基中增殖顯著，發(fā)酵后菌落數(shù)比發(fā)酵前增加了～460倍。36h時測得最大油脂含量為14.21％，油脂產(chǎn)量為0.067 mg/mL，堿木質(zhì)素轉(zhuǎn)化率為28％。其中油脂脂肪酸組成主要為棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)。結(jié)合GPC、31P NMR、HSQC-NMR結(jié)果