白蟻及其腸道微生物來源木質(zhì)纖維素酶基因的克隆與表達.pdf

1、隨著能源危機和溫室效應(yīng)問題的日益嚴(yán)重，使用可再生的木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)生物燃料受到越來越多國家的關(guān)注。白蟻具有高效的木質(zhì)纖維素消化能力，是生物質(zhì)能源生產(chǎn)的重要模型，也是一些新型木質(zhì)纖維素酶的潛在來源。
　　本文的研究對象為高等培菌白蟻黃翅大白蟻Macrotermes barneyi，實驗室前期對其腸道各部分進行比較轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了很多注釋為木質(zhì)纖維素酶的基因，包括漆酶、β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶等。在中腸表達量較高的β葡萄糖苷酶

2、(MbBG)和內(nèi)切葡聚糖酶(MbEG)已經(jīng)成功異源表達，并對酶活性質(zhì)進行了研究，但是對于白蟻漆酶的相關(guān)研究還較少。另外實驗室前期在黃翅大白蟻后腸分離得到了具有木聚糖酶活性以及具有漆酶活性的微生物，對于這些微生物來源的木聚糖酶和漆酶所起的作用我們還不清楚。為了研究這些蛋白在白蟻木質(zhì)纖維素降解中所發(fā)揮的作用，我們進行了以下研究:
　　1.M.barneyi自身由來漆酶基因的克隆與表達。對前期M.barneyi轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中被注釋為漆

3、酶基因（MbLac）的序列進行比對和進化樹分析，推測該基因為M.barneyi自身來源。我們以M.barneyi唾液腺-前腸的cDNA為模板，PCR擴增得到了MbLac基因，并將該基因在E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)以及畢赤酵母GS115中異源表達。結(jié)果顯示，在E.coli JM109和E.coli BL21(DE3)中均可重組表達MbLac，但重組蛋白無漆酶活性，可能因為大腸桿菌不具備對蛋白進行二級結(jié)構(gòu)修飾

4、的能力。MbLac在畢赤酵母GS115中不能表達，Western blotting檢測不到信號，可能由于密碼子偏好性使得白蟻漆酶不能在酵母中表達。
　　2.M.barneyi后腸微生物由來漆酶基因的克隆與表達。從M.barneyi中分離到一株具有漆酶活性的高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis CMC2)。從中克隆漆酶CotA基因，全長為1533 bp，編碼510個氨基酸和一個終止密碼子。將該基因在E.coliJM

5、109中異源表達和純化。得到的重組蛋白，以ABTS為底物時最適溫度和pH分別為70℃和5.0。該酶在偏堿性的環(huán)境中比較穩(wěn)定。重組酶對ABTS的Km值為0.278 mM，最大反應(yīng)速率為555.55U/mg。重組CotA可以對靛藍、結(jié)晶紫和孔雀綠進行脫色，脫色3小時后脫色率可達到80％。
　　3.M.barneyi后腸微生物由來木聚糖酶基因的表達。將M.barneyi后腸類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.Mb1)來源的Xy

6、lMb1基因在E.coli JM109中異源表達，使用Ni-NTA柱純化得到大量重組蛋白。以Birchwood xylan為底物，測得重組酶的比活力為3203.12 U/mg。
　　4.白蟻木質(zhì)纖維素酶的協(xié)同作用。將M.barneyi自身的β-葡萄糖苷酶突變體BGDS-5和來自恒春新白蟻的內(nèi)切葡聚糖酶突變體EG71在E.coli BL21中進行了共表達，兩個蛋白都可表達，且可以協(xié)同作用降解濾紙和磷酸處理的微晶纖維素(PASC)。另

7、外我們研究了重組CotA、XylMb1、BGDS-5和EG71對濾紙和PASC的協(xié)同降解作用，四種酶降解濾紙和PASC時的協(xié)同因子分別為1.63和1.4375。
　　總之，本文首先克隆表達了黃翅大白蟻自身的漆酶基因MbLac以及其腸道微生物來源的木聚糖酶基因XylMb1和漆酶基因CotA，然后研究了白蟻及共生微生物來源的木質(zhì)纖維素酶（CotA、XylMb1、BGDS-5和EG71）對濾紙和PASC的協(xié)同降解作用。本文加深了我們對于