基于非培養(yǎng)生物技術(shù)的堆肥微生物群落研究及木質(zhì)纖維素降解.pdf

1、針對(duì)堆肥化環(huán)境微生物的復(fù)雜性以及木質(zhì)纖維素難降解的特性，本文以農(nóng)業(yè)秸稈為主要原料，采用好氧堆肥，從物理化學(xué)、酶學(xué)以及基于非培養(yǎng)生物技術(shù)的微生物群落結(jié)構(gòu)演替等方面較系統(tǒng)地研究了接種黃孢原毛平革菌對(duì)堆肥發(fā)酵進(jìn)程和木質(zhì)纖維素降解的影響；并綜合運(yùn)用多種非培養(yǎng)生物研究方法與數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法系統(tǒng)地研究堆肥化過(guò)程中微生物群落演替規(guī)律；基于上述規(guī)律研究其降解機(jī)理與特性并從堆肥化各階段選育高效優(yōu)勢(shì)的降解菌株，為堆肥工藝的優(yōu)化和接種劑的開發(fā)提供依據(jù)。

2、在稻草固態(tài)發(fā)酵體系中同時(shí)接種土壤微生物和黃孢原毛平革菌，用磷脂脂肪酸(PLFA)譜圖分析法研究發(fā)酵過(guò)程的微生物群落和生物量變化，同時(shí)監(jiān)測(cè)木質(zhì)纖維素降解率的變化。結(jié)果表明，復(fù)合微生物體系降解木質(zhì)纖維素的效率明顯高于單一菌種的效率。根據(jù)標(biāo)志性脂肪酸的變化，在發(fā)酵第6d，革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌的含量都達(dá)到了最高值，其中，革蘭氏陽(yáng)性菌的含量較低；真菌和細(xì)菌的脂肪酸含量比值變化范圍為0.2～0.5，說(shuō)明真菌是降解木質(zhì)纖維素的主要群落。主

3、成分分析結(jié)果顯示發(fā)酵后期以18C不飽和脂肪酸為主，與標(biāo)志性脂肪酸分析結(jié)果一致，同時(shí)跟木質(zhì)纖維素降解率的變化趨勢(shì)對(duì)應(yīng)，因此PLFA分析法可以較好地反映稻草固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和生物量的變化。P.chrysosporium對(duì)應(yīng)單體PLFA與木質(zhì)纖維素相關(guān)性分析顯示革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌在降解木質(zhì)素上具有相同的效率，P.chrysosporium是降解木質(zhì)素的主要真菌。 用RFLP方法和酶活檢測(cè)方法研究了在農(nóng)業(yè)廢物堆肥一次發(fā)酵和

4、二次發(fā)酵期間添加黃孢原毛平革菌對(duì)微生物多樣性和木質(zhì)纖維素降解酶系的影響。結(jié)果表明，在不同發(fā)酵期接種P.chrysosporium對(duì)堆肥進(jìn)程的影響不同：(1)三種典型的限制性內(nèi)切酶AluⅠ、HaeⅢ和TaqⅠ在分析堆肥細(xì)菌微生物多樣性的靈敏性上，HaeⅢ效果最好，AluⅠ次之，TaqⅠ則不是很適用于分析堆肥細(xì)菌微生物多樣性。添加的P.chrysosporium對(duì)堆肥系統(tǒng)中某些微生物更具有一定的選擇作用，使其成為優(yōu)勢(shì)物種以促進(jìn)堆肥物質(zhì)的降解

5、，多樣性有所降低，二次接種能夠鞏固一次接種效果；(2)接種P.chrysosporium能夠促進(jìn)堆肥體系中的木質(zhì)纖維素降解，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示接種P.chrysosporium的堆體中木質(zhì)素降解率要明顯高于未接種的堆體。接種P.chrysosporium對(duì)木聚糖酶活和CMC酶活的分泌沒(méi)有明顯影響，對(duì)Lip和Mnp酶活產(chǎn)生有促進(jìn)作用，但是對(duì)Lac的產(chǎn)生有一定抑制作用。 組合應(yīng)用了三類非培養(yǎng)生物技術(shù)，即PLFA法、RFLP法、DGGE法，

6、分析農(nóng)業(yè)廢物堆肥化中微生物群落和多樣性的變化。結(jié)果表明三類方法顯示的信息并不完全一致：(1)PLFA法檢測(cè)的樣點(diǎn)數(shù)據(jù)PCA分布比較離散，說(shuō)明每個(gè)樣點(diǎn)都具有其特征圖譜，樣點(diǎn)選取具有代表性。三類方法中以PLFA數(shù)據(jù)指示的微生物多樣性最高，同時(shí)PLFA數(shù)據(jù)可以表征較完整的微生物群落結(jié)構(gòu)變化并較為明確的表征微生物生物量的變化。(2)RFLP法檢測(cè)的樣點(diǎn)和條帶信息PCA分布都比較集中，數(shù)據(jù)還顯示在堆肥后期的細(xì)菌群落具有不穩(wěn)定性，RFLP法指示的微

7、生物多樣性較低；(3)DGGE方法檢測(cè)的數(shù)據(jù)顯示堆肥過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)至少經(jīng)歷了三個(gè)階段的演替，即嗜溫細(xì)菌群落，高溫細(xì)菌群落和腐熟期細(xì)菌群落。 根據(jù)從農(nóng)林廢物堆肥中篩選得到的木質(zhì)素降解優(yōu)勢(shì)土著微生物枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌、黑曲霉、簡(jiǎn)青霉、栗褐鏈霉菌，依據(jù)PLFA-PLS定量分析所得堆肥化二次發(fā)酵期有效的木質(zhì)素降解微生物群落組成比例混合接種至稻草基質(zhì)發(fā)酵瓶中，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)L9(34)優(yōu)化混合比例，以期研究開發(fā)一種基于木質(zhì)素降