香港牡蠣中麻痹性貝類毒素結合蛋白分離純化及構效分析.pdf

1、麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)是一種可以與細胞膜離子通道結合阻礙神經(jīng)傳導，引起神經(jīng)性麻痹的毒素。PSP主要合成于藍藻，是目前由有害藍藻引起的中毒事件中最常見的對人體影響較為嚴重的毒素之一。貝類是海洋中以攝食藻類為主的動物，它們在攝食大量藻類的同時，會對藻中的物質如PSP進行富集，人和動物食用后就會導致PSP中毒，帶來嚴重的經(jīng)濟損失。
　　本文將產PSP藻——微小亞歷山大藻(Al

2、exandrium minutum)首先進行室外培養(yǎng)和PSP的提取，再投喂給我國兩廣主要的經(jīng)濟貝類——香港牡蠣(Crassostreahongkongensis)進行人工蓄毒，取其內臟對PSP結合蛋白進行提取，并逐步通過排阻色譜→離子交換色譜→疏水色譜對PSP結合蛋白進行分離純化，以小鼠生物法(MBA)和液相法(HPLC-FLD)等作為檢測手段確定PSP的位置與組成，再通過SDS-PAGE測定其分子量，又對PSP結合蛋白進行HPLC-M

3、S-MS鑒定，并采用生物信息學來分析其構效，最后研究了PSP結合蛋白與PSP之間的吸附動力學。主要結果如下:
　　(1)為準備用于香港牡蠣蓄毒培養(yǎng)的微小亞歷山大藻、PSP等樣品，本文對微小亞歷山大藻進行培養(yǎng)并采用不同破壁方法:超聲法、微波法和凍融法對PSP進行提取。不同方法下提取得到的提取液通過MBA和HPLC-FLD檢測PSP，并確定采用凍融進行優(yōu)化試驗，得到響應面優(yōu)化二次回歸方程為:Y=193.8+13.75A-35.35B+

4、12.58C-20.2AB+6.95AC-13.35BC-38.75A2-78.05B2-51.70C2。驗證實驗確定的最佳條件為:凍融3次，解凍溫度37℃，pH=7.8，提取液的毒力可達6616±101MU。
　　(2)對香港牡蠣進行PSP蓄毒培養(yǎng)，并對其內臟進行PSP結合蛋白的分離純化。首先研究不同pH緩沖液對PSP結合蛋白提取的影響，確定在pH=8下進行提取，并通過硫酸銨分級沉淀對PSP結合蛋白進行初步純化，確定硫酸銨飽和度

5、為40％～70％。然后采用逐步分離:首先進行S-100分離純化，收集PSP結合蛋白陽性峰;再對S-100收集得到的PSP結合蛋白陽性峰進行Q-FF分離，進行梯度洗脫收集PSP結合蛋白陽性峰;最后對Q-FF收集得到的PSP結合蛋白陽性峰進行RP-HPLC制備。通過SDS-PAGE對分離純化過程中蛋白組成變化進行監(jiān)測，得到所提取的PSP結合蛋白的分子量為:33.5kDa。
　　(3)將HPLC-MS-MS用于PSP結合蛋白的鑒定和構效

6、分析:①用DNATSAR分析得出其分子量為36.08kDa。該蛋白共含有335個氨基酸，極性氨基酸和疏水性氨基酸分別占蛋白分子量的38.82％和35.35％，等電點pI=7.25。BLATS分析該蛋白與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的同源性高達78％左右。②利用Predictprotein、NCBI、RPS-BLAST和ConSurf可知其二級結構中α螺旋占28.06％，β折疊占30.75％，無規(guī)則卷曲占41.19％。兩個結構域為

7、GADPH C端區(qū)域家族和GADPH NAD結合區(qū)域，活性位點位于具有高保守性的148-155位。③GAPDH與PSP中大量酰胺結構具有較高的親和性，進一步證明該蛋白為PSP結合蛋白。
　　(4)最后研究了PSP結合蛋白（純度為:67.47％）對PSP的吸附動力學。單因素試驗獲得的最佳吸附條件為:pH=9，蛋白濃度3mg/mL，反應時間24h。在此基礎上研究了吸附動力學，通過動力學一級和二級方程擬合可知:PSP結合蛋白對PSP的吸