檢測腹瀉性貝類毒素大田軟海綿酸的免疫傳感器的研究.pdf

1、隨著世界范圍內(nèi)環(huán)境惡化，海洋赤潮頻發(fā)，赤潮藻類會產(chǎn)生多種海洋生物毒素，其中主要包括腹瀉性、麻痹性和神經(jīng)性毒素。其中，腹瀉性毒素經(jīng)過動物實(shí)驗(yàn)證明具有潛在的致癌性、致畸性和致突變性等，而短期內(nèi)會出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、暈眩等癥狀，對人體健康具有極大得威脅。因此急需快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法來檢測腹瀉性毒素中的主要種類-大田軟海綿酸。
　　本文首先簡單介紹了腹瀉性貝類毒素以及針對大田如海綿酸的檢測方法，并簡單闡述生物素-親和素系統(tǒng)及納米金在免疫傳感

2、器中的應(yīng)用。然后設(shè)計(jì)研發(fā)了三種免疫傳感器，包括將簡單的免疫原理應(yīng)用到研發(fā)試劑盒，將生物素-親和素系統(tǒng)引入傳統(tǒng)的免疫傳感器實(shí)現(xiàn)信號放大，以及將納米金和基于生物素-親和素系統(tǒng)以及辣根辣根過氧化物酶抗原抗體的循環(huán)放大系統(tǒng)應(yīng)用于構(gòu)建更為靈敏的生物免疫傳感器。三種傳感器都能有效的應(yīng)用于檢測大田軟海綿酸。
　　本論文完成的主要工作和創(chuàng)新點(diǎn)如下:
　　1.研制了新型的快速檢測大田軟海綿酸貝類毒素的試劑盒，設(shè)計(jì)了基于試劑盒的現(xiàn)場檢測儀器。<

3、br>　　利用競爭性免疫反應(yīng)，設(shè)計(jì)了一種用于檢測大田軟海綿酸(OA)的試劑盒。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，該試劑盒的檢測限為0.19μg/L、線性范圍02-10μg/L、與鰭藻毒素(DTX)的交叉反應(yīng)率為23.6％，對其他毒素的交叉反應(yīng)率幾乎為0，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)說明該試劑盒具有較好的回收率。該試劑盒對重金屬離子具有較好的抗干擾性，且目前該試劑盒能保存到6個(gè)月。該試劑盒的檢測時(shí)間在90min內(nèi)，且成本是Beacon試劑盒的1/30。基于開發(fā)的試劑盒，完成

4、了現(xiàn)場光學(xué)檢測儀器Bionice-Eye的設(shè)計(jì)，該儀器操作簡單，直接顯示結(jié)果，結(jié)合試劑盒非常適用于現(xiàn)場快速檢測和篩查，實(shí)際樣品的檢測結(jié)果與高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用((HPLC-MS)和酶標(biāo)儀都有很好的一致性。
　　2.提出了結(jié)合生物素-親和素的免疫傳感器設(shè)計(jì)方法，提高檢測OA靈敏度的設(shè)計(jì)方法
　　在試劑盒的基礎(chǔ)上，引入生物素-親和素系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了信號放大的生物傳感器。該傳感器的檢測限為0.04μg/L，線性范圍為0.01-10μg/

5、L，相比于試劑盒，該傳感器的檢測限降低了5倍，線性范圍的下限降低了20倍;另外，該傳感器對DTX1的交叉反應(yīng)率為44.14％，對其他毒素的交叉反應(yīng)率幾乎為0，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)證明該傳感器用于檢測OA的回收率范圍在91.09％-111.86％之間，變異系數(shù)CV低于15％。檢測OA與DTX1混合加標(biāo)的回收率范圍在81.98-132.61％，說明該傳感器對于檢測OA與DTX1都具有較好的準(zhǔn)確性。
　　3、提出了結(jié)合納米金和生物素-親和素的級

6、聯(lián)放大的免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對OA超低濃度的檢測。
　　納米金具有很大的比表面積且與生物分子具有較高的親和力，因此，使其表面結(jié)合二抗-辣根過氧化物酶(SAb-HRP)和HRP，有了很大程度的信號放大。另外，通過引入生物素-親和素系統(tǒng)以及辣根過氧化物酶及其抗體形成的免疫復(fù)合物構(gòu)成三級級聯(lián)放大，形成具有更強(qiáng)放大作用的生物傳感器，該級聯(lián)放大免疫傳感器的檢測限為0.0025μg/L，線性范圍為0.002-5μg/L，線性區(qū)間的下限0.002