豬白細(xì)胞介素2-6嵌合基因的融合表達(dá)及活性研究.pdf

1、疫苗免疫接種是控制豬傳染病的重要手段,但由于疫苗自身的缺點(diǎn)以及免疫抑制病的發(fā)生而帶來的疫苗免疫失敗、免疫保護(hù)率低等情況時(shí)而發(fā)生。因此,提高疫苗的免疫力和免疫保護(hù)效果對(duì)控制豬傳染病具有重要意義。細(xì)胞因子作為免疫佐劑可以提高疫苗的免疫效果、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力,因此細(xì)胞因子作為免疫增強(qiáng)劑的研究成為目前研究的熱點(diǎn)。
　　 白細(xì)胞介素-2(1L-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-2)分別屬于Th1、Th2型細(xì)胞因子,介導(dǎo)細(xì)胞免疫與體液免疫。大

2、量研究表明,IL-2、IL-6可以作為免疫佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫效果。為探討IL-2/IL-6用作疫苗佐劑的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用機(jī)理及效果,研究高效豬基因工程免疫增強(qiáng)劑獲得一種能夠平衡Th1和Th2應(yīng)答的新型、高效的免疫增強(qiáng)劑。本研究從LPS脂多糖刺激過的豬脾臟細(xì)胞中提取PoIL-6 RNA,進(jìn)一步構(gòu)建rpQE-30/PoIL-6原核表達(dá)質(zhì)粒,對(duì)其原核表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化,研究其生物學(xué)活性及對(duì)脾臟細(xì)胞的增殖活性。然后采用重疊延伸PCR(splic

3、ing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)技術(shù)將豬白介素-2成熟肽基因(PoIL-2)和豬白介素-6成熟肽基因(PoIL-6)構(gòu)建成重組嵌合基因(PoIL-2-linker-PoIL-6)并克隆入pGEM-T easy克隆載體；將含PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因的重組克隆陽性質(zhì)粒經(jīng)BamtHⅠ、HindⅢ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的原核表達(dá)載體pQE30粘端連接,篩選陽性重組表達(dá)質(zhì)粒在E.Co

4、il中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)表達(dá)的重組融合蛋白(rPoIL-2-linker-PoIL-6)通過尿素變性、復(fù)性液復(fù)性、PBS溶液透析等步驟進(jìn)行純化并進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。分別檢測(cè)rPoIL-6、rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白與抗PoIL-2、PoIL-6單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)及促豬外周血T淋巴細(xì)胞、豬脾臟細(xì)胞的增殖活性的活性。
　　 結(jié)果表明:成功克隆了rPoIL-6成熟肽基因,基因全長(zhǎng)573bp；并構(gòu)建成功rpOE-30/P

5、oIL-6原核表達(dá)質(zhì)粒,其在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的rPoIL-6蛋白分子量大小約為20KD;經(jīng)純化后的蛋白質(zhì)純度在95％以上;rPoIL-6蛋白能和抗PoIL-6單抗發(fā)生特異性反應(yīng),MTS法檢測(cè)得出,rPoIL-6蛋白活性為1.23×106UI/mg,具有促進(jìn)豬脾臟細(xì)胞的增殖活性。
　　 成功構(gòu)建了PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重組原核表達(dá)質(zhì)粒rpQE-30/PoIL-2-linker-PoIL-6；表達(dá)的r

6、PoIL-2-linker-PoIL-6蛋白經(jīng)純化后純度在96％以上。rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白分別可與抗PoIL-2、PoIL-6單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng),并可顯著促進(jìn)豬外周血T淋巴細(xì)胞和豬脾臟細(xì)胞的增殖。rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白促豬外周血T淋巴細(xì)胞和脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性也與濃度呈現(xiàn)相關(guān)性,相對(duì)而言,rPoIL-2-linker-PoIL-6和rPoIL-2蛋白對(duì)照具有明顯促豬外周血T淋巴細(xì)胞增

7、殖所需要的最低濃度較高(最大稀釋度分別為1:256,0.598ug/ml;1:512,0.322ug/mL),且rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白的促增殖活性稍優(yōu)于相同稀釋度的rPoIL-2蛋白對(duì)照。與IL-2的促外周血T細(xì)胞增殖活性所需要的蛋白劑量不同,極低濃度(最大稀釋度1:214)的rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白、rPoIL6蛋白和rhIL-6蛋白即可刺激豬脾臟淋巴細(xì)胞的增殖；相對(duì)而言,rPoIL-2-

8、linker-PoIL-6蛋白的促豬脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性稍優(yōu)于rPoIL-6蛋白對(duì)照,但二者均稍低于rhIL-2標(biāo)準(zhǔn)品。這表明rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在動(dòng)物體外具有單rPoIL-2、rPoIL-6蛋白疊加的生物學(xué)活性,且其活性可能優(yōu)于兩種單rPoIL-2、rPoIL-6蛋白混合應(yīng)用。
　　 本研究成功構(gòu)建了rpQE-30/PoIL-6原核表達(dá)質(zhì)粒、PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重組原核