蜂毒素與基因變構(gòu)人白細(xì)胞介素-2融合基因的原核質(zhì)粒構(gòu)建、表達(dá)、純化及活性測(cè)定.pdf

1、目的：構(gòu)建免疫毒素——蜂毒肽與變構(gòu)人白細(xì)胞介素-2融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒；并通過(guò)對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)而探討其對(duì)宿主菌E.coli.生長(zhǎng)的影響，篩選穩(wěn)定表達(dá)宿主菌株，表達(dá)發(fā)酵，目的蛋白定位分析；對(duì)可溶部分進(jìn)行純化，得到目的蛋白；研究目的蛋白在體外的生物學(xué)活性。 方法：以質(zhì)粒pGEX-4T-2/Melittin-IL-2(88Arg)為模板，通過(guò)PCR的方法定點(diǎn)誘變?yōu)镸elittin-IL-2(88Arg，125Ala)；目的基因進(jìn)行T-A

2、克隆，經(jīng)NcoI和HindⅢ雙酶切、DNA序列測(cè)定分析鑒定，正確克隆命名為pMD18-T/M-IL-2(88Arg，125Ala)；如上雙酶消化克隆質(zhì)粒和pET-32a(+)后回收片段連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，同樣雙酶切鑒定，正確克隆命名為pET/M-IL-2(88Arg,125Ala)。表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；ELISA分析表達(dá)產(chǎn)物；測(cè)定誘導(dǎo)不同時(shí)間宿主菌的OD600值并繪制生長(zhǎng)曲線及對(duì)誘導(dǎo)不同時(shí)間的宿主菌進(jìn)

3、行活菌計(jì)數(shù)；28℃，1mM IPTG再誘導(dǎo)存活重組菌，SDS-PAGE凝膠電泳和Westem-Blotting分析表達(dá)產(chǎn)物；擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)親和層析、Enterokinase酶切和離子交換層析進(jìn)行純化，BCA法進(jìn)行融合蛋白濃度測(cè)定。用液相測(cè)定法研究融合蛋白的抑菌活性，用MTI法研究融合蛋白對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖和對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的作用。利用方差分析處理數(shù)據(jù)。 結(jié)果：目的片段長(zhǎng)542bp，測(cè)序分析重組子如預(yù)期突變，無(wú)缺失、插入

4、及框移；ELISA檢測(cè)到目的蛋白表達(dá)。重組子誘導(dǎo)表達(dá)兩小時(shí)宿主菌OD600值由0.8下降至0.6；活菌計(jì)數(shù)由108/ml降至104/ml；SDS-PAGE凝膠電泳和Western-Blotting分析存活重組菌再表達(dá)產(chǎn)物見(jiàn)約37kDa處目的蛋白可溶和非可溶均有表達(dá)；對(duì)可溶部分初步純化后，每升菌液可得融合蛋白62μg。純化后的融合蛋白抑菌率呈濃度依賴(lài)性；對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖作用與IL-2的差異不具有顯著性(p>0.05)；對(duì)Hela細(xì)胞