豬白細(xì)胞介素15基因的克隆、表達(dá)及其生物活性初步測(cè)定.pdf

1、白細(xì)胞介素15(IL-15)是與白細(xì)胞介素2(IL-2)有相似生物學(xué)活性，但無(wú)序列同源性的新細(xì)胞因子，其體內(nèi)分布遠(yuǎn)較IL-2廣泛，在免疫調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答尤其是在抗腫瘤免疫應(yīng)答中有重要作用。1997年發(fā)現(xiàn)的豬白細(xì)胞介素15(porcine interleukin-15，pIL-15)是與一種人IL-15活性相似的細(xì)胞因子。 根據(jù)Genbank已發(fā)表的豬IL-15基因序列(NM214390)設(shè)計(jì)并合成了特異性引物，無(wú)菌采取榮昌豬前腔靜

2、脈血，分離出淋巴細(xì)胞，經(jīng)刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)后提取的總RNA為模板，應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)豬IL-15基因開(kāi)放閱讀框(ORF)克隆、序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pIL-15 ORF由489個(gè)核苷酸組成，推測(cè)其編碼產(chǎn)物由162個(gè)氨基酸組成。核苷酸序列分析比對(duì)顯示，榮昌豬IL-15與Genbank已發(fā)表的pIL-15序列的核苷酸、氨基酸同源性很高，均為99.4％，與人、獼猴、牛、綿羊、犬、貓的核苷酸同源性為84.1％～89.8％

3、，與小鼠的同源性為77.4％，與雞的同源性僅為27.8％，與人、獼猴、牛、綿羊氨基酸同源性均在80.0％以上，與雞的同源性僅為34.8％。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，pIL-15與pIL-2結(jié)構(gòu)有很大的相似性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)則表明豬IL-15與哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較近，與雞進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。 研究發(fā)現(xiàn)，IL-15的分泌受到多種因素的調(diào)控。其中，IL-15的長(zhǎng)信號(hào)肽是影響IL-15蛋白分泌的主要因素，本實(shí)驗(yàn)借鑒人IL-15體外表達(dá)的經(jīng)驗(yàn)，除去了含有48個(gè)

4、氨基酸殘基的信號(hào)肽。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出榮昌豬IL-15成熟肽基因，進(jìn)行pMD18-T載體克隆，通過(guò)對(duì)質(zhì)粒pMD18-T-IL-15及pET-32a(+)進(jìn)行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切、連接，將pIL-15基因定向插入 pET-32a(+)，經(jīng)雙酶切和 PCR 鑒定表明，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32-pIL-15，并轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明，表達(dá)產(chǎn)物以融合表達(dá)的包涵體形式存