母胎間差異DNA甲基化標(biāo)記的篩選與鑒定.pdf

1、研究背景：胎兒產(chǎn)前親子鑒定在法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定中占有重要的地位。傳統(tǒng)的胎兒產(chǎn)前親子鑒定通常需要穿刺抽取羊水、臍血或絨毛取樣，但這些侵入性取樣存在流產(chǎn)、宮內(nèi)感染、胎兒損傷等風(fēng)險(xiǎn)，而且還會(huì)受到妊娠時(shí)間的限制。長(zhǎng)期以來(lái)，探索無(wú)創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定方法一直是法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題。研究發(fā)現(xiàn)，孕期母血中含有多種胎兒細(xì)胞及胎兒游離核酸。前者因在母血中含量太少，且難以分離和富集，致使其在胎兒產(chǎn)前親子鑒定中的應(yīng)用價(jià)值有限；后者為法醫(yī)學(xué)無(wú)創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親

2、子鑒定帶來(lái)了新的契機(jī)。目前，盡管在利用孕母血中cffDNA進(jìn)行胎兒產(chǎn)前親子鑒定方面取得了一些進(jìn)展，但仍存在以下問(wèn)題：①cffDNA少，難以富集，加之片段很小，致使可檢出的胎兒遺傳標(biāo)記有限；②因大量母體DNA的干擾，檢測(cè)結(jié)果均為母親和胎兒的混合基因型，使得父權(quán)判斷的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估更為復(fù)雜。表觀遺傳學(xué)的最新研究成果證實(shí)，母親和胎兒 DNA之間存在眾多的DMR，這些 DMR的發(fā)現(xiàn)不僅為臨床進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前診斷奠定了基礎(chǔ)，亦為法醫(yī)學(xué)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性胎兒

3、產(chǎn)前親權(quán)鑒定提供了新的技術(shù)手段。與臨床上無(wú)創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前診斷不同的是，法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定必需進(jìn)行基因分型。由此，母胎間 DMR內(nèi)的SNP位點(diǎn)自然成了關(guān)注的對(duì)象。聯(lián)合分析差異甲基化標(biāo)記和SNP位點(diǎn)成為進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定的全新策略?；诖耍柑ラg差異DNA甲基化標(biāo)記的篩選與鑒定便成為利用表觀遺傳學(xué)標(biāo)記進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定非常重要的基礎(chǔ)性工作。
　　目的：在全基因組范圍內(nèi)篩選母胎間存在顯著DNA甲基化差異且含有頻率較好的SNP位

4、點(diǎn)的DMR，為利用表觀遺傳學(xué)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性胎兒產(chǎn)前親子鑒定提供候選標(biāo)記。
　　方法：①采用甲基化 DNA免疫沉淀(MeDIP)結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)及 CpG島芯片(NimbleGen HGl8 CpG Promoter)，以母體外周血以及胎兒胎盤(pán)絨毛膜（CVS）為研究對(duì)象，系統(tǒng)檢測(cè)母胎間DNA甲基化水平差異；②利用重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)對(duì)芯片篩選的DMR進(jìn)行驗(yàn)證；③挑選部分含SNP標(biāo)記以及甲基化敏感的限制酶酶切位點(diǎn)的片段，以孕母外周血血漿中的cf

5、fDNA進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，評(píng)價(jià)其作為母體循環(huán)中胎兒表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物的特異性、穩(wěn)定性與靈敏度。
　　結(jié)果：①根據(jù)甲基化芯片檢測(cè)結(jié)果，以 PeakDMvalue>0.5為標(biāo)準(zhǔn)，共發(fā)現(xiàn)185個(gè)母親組高甲基化區(qū)域以及303個(gè)母親組低甲基化區(qū)域。488個(gè)DMR中，75個(gè)（15.37％）位于CpG島區(qū)域413個(gè)（84.63%）位于啟動(dòng)子區(qū)域。母親組高甲基化片段中，18個(gè)（5.94%）位于CpG島，285個(gè)（94.06%）位于啟動(dòng)子區(qū)域。上述DM

6、R隨機(jī)分布在所有的染色體上，其中1號(hào)染色體上最多，有42個(gè)，其次是19號(hào)染色體35個(gè)、5號(hào)染色體30個(gè)、22號(hào)染色體30個(gè)、17號(hào)染色體27個(gè)、11號(hào)染色體25個(gè)、7號(hào)染色體24個(gè)。利用數(shù)據(jù)庫(kù)信息，以DM value>0.5、SNP頻率>0.2為標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選出91個(gè)符合條件的DMR。然后根據(jù)DM值、甲基化差異程度、SNP頻率以及酶切位點(diǎn)的位置等因素綜合考慮，最終選擇了15個(gè)DMR作后續(xù)BSP的驗(yàn)證分析。②驗(yàn)證的15個(gè)DMR中，與芯片結(jié)

7、果一致并且含有與SNP位點(diǎn)鄰近的MSRE酶切位點(diǎn)的DMR有3個(gè)。③3個(gè)靶DMR中, chr10：101281722-101282479片段（NCBI36/hg18）在六對(duì)樣本中母親 DNA均可被BstUI和HinP1I雙酶完全切割，胎兒絨毛DNA均不能被切割。其它兩個(gè)片段chr9：138021600-138022048（NCBI36/hg18）以及chr17：34251133-34251505（NCBI36/hg18）的酶切情況體現(xiàn)出了