隨齡變化DNA甲基化片段的篩選.pdf

1、研究背景：個體年齡推斷一直是法醫(yī)學研究的重點和難點。當前實際應用比較多的是通過檢測骨骼、牙齒等骨性指征，應用法醫(yī)人類學模型進行計算從而推斷個體的年齡。該方法比較成熟，而且誤差也較小。但是遇到只有血液或軟組織檢材的案例時，由于缺乏骨性指征，其應用就會受到極大限制。隨著分子生物學的發(fā)展，為了實現(xiàn)通過檢測血液或軟組織來推斷個體年齡，有學者曾提出通過檢測端粒的長度和線粒體DNA的損傷程度來推斷個體年齡。這兩種方法均有一定的參考性，但因為精確度有

2、限，尚難以應用于法醫(yī)學實踐。近年來隨著表觀遺傳學研究的興起，研究者發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在基因組中含量豐富、分布廣泛，并且與年齡之間存在緊密的相關性。因此，如果能夠篩選出隨年齡變化的DNA甲基化片段，構建其與年齡之間的數(shù)學模型，將有可能實現(xiàn)通過對DNA甲基化狀態(tài)進行檢測來推斷個體的年齡，有望為個體年齡推斷提供一種新的技術手段。
　　 目的：通過比較不同年齡段個體基因組DNA甲基化狀態(tài)，篩選出隨年齡變化的甲基化片段，為進一步探索 DNA

3、甲基化與年齡之間的相關性打下基礎。
　　 方法：選擇“老年”和“少年”兩個年齡組健康個體的外周血作為檢測對象，提取基因組DNA。用甲基化敏感的限制酶NotⅠ對兩組基因組DNA進行酶切，酶切片段接上接頭后進行PCR擴增得到酶切片段的擴增產(chǎn)物。先以老年組酶切片段擴增產(chǎn)物作為Tester，少年組酶切片段擴增產(chǎn)物作為Driver進行正向消減雜交。經(jīng)過兩到三輪消減雜交后，即可得到老年相對少年的差異甲基化DNA片段。然后，再以少年組酶切片段

4、擴增產(chǎn)物作為Tester、老年組酶切片段擴增產(chǎn)物作為Driver進行反向消減雜交，得到少年相對于老年的差異甲基化DNA片段。最后，再對篩選出的兩組基因片段進行純化、克隆、測序，鑒定候選靶片段并通過甲基化測序驗證其差異程度。
　　 結果：（1）利用甲基化敏感的限制酶NotⅠ通過正、反向消減雜交，初步篩選出10條在老年和少年之間存在甲基化差異的候選靶DNA片段；（2）甲基化測序顯示，初篩出的10條候選靶片段中有3條在不同老年和少年組