dna甲基化與臨床應(yīng)用_第1頁(yè)
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1、DNA甲基化與臨床應(yīng)用,目錄,為什么熊貓是黑白的?,—— 基因決定命運(yùn),同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但他們長(zhǎng)大成人后在性格、健康方面往往存在很大差異。,先從表觀遺傳學(xué)談起,,相同的基因型,不同的表型,,?,基因,環(huán)境,表型,,表觀遺傳學(xué),現(xiàn)代表觀遺傳學(xué),概念: 基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下,基因的表達(dá)水平與功能發(fā)生改變,并產(chǎn)生可遺傳的表型。表觀遺傳學(xué)的現(xiàn)象(基因表達(dá)的調(diào)控方式):DNA甲基化---表觀遺傳學(xué)的核

2、心(最初始的調(diào)控方式)組蛋白修飾MicroRNAGenomic imprinting,不同層次表達(dá)調(diào)控,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶: DNMT胞嘧啶: Cytosine5’-甲基胞嘧啶: 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸: SAM S-腺苷- 高半胱氨酸:SAH,DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下,在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5‘碳位以共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。,DNA甲基化的概念,D

3、NA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT),哺乳動(dòng)物體內(nèi)有三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶: ——DNMT1、 DNMT3A和DNMT3B。DNMT1--- 持續(xù)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶;與甲基化相關(guān),缺乏引起基因組低甲基化,染色體缺失、重排、突變畸形。DNMT3A、DNMT3B--- 從頭甲基轉(zhuǎn)移酶;與去甲基化相關(guān),在胚胎干細(xì)胞和早期胚胎中高度表達(dá),缺乏引起胚胎死亡,在腫瘤組織中廣泛高表達(dá)。,通

4、常啟動(dòng)子和第一個(gè)外顯子區(qū),CpG序列密度非常高,超過均值5倍以上,成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)。結(jié)構(gòu)基因組中70%~ 90% 的獨(dú)立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 島約有60%以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。 — 是結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。,CpG島(CpG island),預(yù)測(cè)軟件 http://pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_qu

5、ery.html http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/,目錄,DNA甲基化的生物學(xué)作用,在發(fā)育和分化中調(diào)控基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制特征性表型基因的表達(dá)(膚色、毛發(fā)) X染色體的失活(X-inactivation )基因印記堿基突變腫瘤代謝,DNA甲基化作為一種可遺傳的表觀遺傳修飾,在體細(xì)胞增殖過程中通過依賴于DNA復(fù)制的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1穩(wěn)定地傳遞給子細(xì)胞。但在胚胎發(fā)

6、育的不同時(shí)期,基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化水平會(huì)發(fā)生劇烈的改變,改變最劇烈的階段為配子形成期與早期胚胎發(fā)育階段,甲基化模式在配子形成時(shí)已經(jīng)建立。,DNA甲基化與胚胎發(fā)育,DNA甲基化在動(dòng)物胚胎和生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的重編程,CPG island的功能:通過甲基化與去甲基化,調(diào)控下游基因的表達(dá) —— 基因表達(dá)的調(diào)控開關(guān),轉(zhuǎn)錄抑制,影響基因表達(dá)

7、,直接抑制基因表達(dá)或甲基化的 CpG雙核苷酸序列可被甲基結(jié)合蛋白家族 識(shí)別,而后者可通過吸引補(bǔ)充組蛋白去乙酞化酶和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶等組蛋白修飾蛋白質(zhì)來改變?nèi)旧|(zhì)的活性 ,以間接方式影響基因表達(dá)。,IAP: intracisternal A particle去甲基化:灰鼠基因(agouti)僅微量表達(dá)甲基化:基因超量表達(dá),特征性表型基因的表達(dá),X染色體的失活,X染色體的失活(X-inactivation ):生長(zhǎng)發(fā)育過程中,雌性哺乳

8、類動(dòng)物細(xì)胞中的兩條X染色體其中一條失去活性的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)失活的染色體上DNA序列都呈高度甲基化,導(dǎo)致絕大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄處于關(guān)閉狀態(tài)。避免因擁有兩條X染色體而產(chǎn)生雙倍 基因產(chǎn)物,保持和雄性動(dòng)物X染色體 數(shù)量及功能上的一致性。,基因組印記?,組織或細(xì)胞中,基因的表達(dá)具有親本選擇性,即只有一個(gè)親本的等位基因表達(dá),而另一親本的等位基因不表達(dá)或很少表達(dá)的現(xiàn)象,相應(yīng)的基因則稱為印記基因。,父系不表達(dá)稱父系印記母系不表達(dá)稱母

9、系印記,基因印記,差異甲基化區(qū)域,差異甲基化區(qū)域(differentially methylated region,DMR),是指染色體上甲基化狀態(tài)具有親本特異性的區(qū)域,即來源于不同親本的DNA序列甲基化狀態(tài)不同的區(qū)域,差異甲基化主要發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū),少數(shù)在外顯子,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的印記基因大多數(shù)具有DMR或受DMR調(diào)控。,堿基C T突變,堿基突變,,,,,,,甲基化

10、 突變,腫瘤細(xì)胞發(fā)生時(shí)常出現(xiàn)DNA甲基化模式的變化,主要包括甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平的提高、基因組整體甲基化水平的降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高,從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定,如染色質(zhì)構(gòu)象異常、轉(zhuǎn)座子激活、原癌基因激活表達(dá)以及抑癌基因被抑制表達(dá)等。,DNA甲基化與腫瘤,目錄,A.基因組甲基化水平(Methylation Content)的分析高效液相色譜高效毛細(xì)管電泳法B.候選基因(Candidate Gene)甲

11、基化分析 甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法重亞硫酸鹽測(cè)序法甲基化特異性的PCR甲基化熒光法(MethyLight)焦磷酸測(cè)序 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法,甲基化檢測(cè)相關(guān)技術(shù),C. 基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜分析 限制性標(biāo)記基因組掃描 甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增 甲基化CpG島擴(kuò)增 差異甲基化雜交 由連接子介導(dǎo)PCR出的HpaII小片斷富集分析 甲基化DNA免疫沉淀法,高效液相色譜法,直

12、接測(cè)序法,焦磷酸測(cè)序法,,通過檢測(cè)CpG對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上C/T滲入的比例對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化程度進(jìn)行定量分析,是目前最可靠的甲基化定量分析方法。,全基因組甲基化圖譜,全基因組甲基化測(cè)序(WGBS),芯片平臺(tái),Illumina 850K芯片可檢測(cè)人全基因組約853,307個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。850K芯片不但保持了對(duì)CpG島,基因啟動(dòng)子區(qū)的全面覆蓋,還特別加強(qiáng)了增強(qiáng)子區(qū)以及基因編碼區(qū)的探針覆蓋。廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞研究、腫瘤和其他復(fù)雜疾病研究,是

13、目前最適合表觀基因組全關(guān)聯(lián)分析研究的全基因組DNA甲基化芯片。,Illumina 850K芯片技術(shù)流程,目錄,正常生物DNA甲基化,DNA甲基化始發(fā)于胚胎早期,隨著組織細(xì)胞分化發(fā)育,基因組DNA經(jīng)歷了去甲基化、區(qū)域性的重新甲基化以及組織特異基因選擇性的去甲基化的過程。最后,這種DNA甲基化模式就相對(duì)穩(wěn)定下來。,腫瘤組織的DNA甲基化,腫瘤中普遍存在DNA甲基化狀態(tài)的改變,其特點(diǎn)是總體的甲基化水平降低與局部的甲基化水平升高。腫瘤細(xì)胞的特

14、征:癌基因 低甲基化 → 被激活抑癌基因 高甲基化 → 被沉默,,,應(yīng)用前景1--腫瘤的早期診斷,抑癌基因發(fā)生異常甲基化是在腫瘤早期就發(fā)生而且一直進(jìn)行的,導(dǎo)致惡性腫瘤表型的表達(dá)優(yōu)點(diǎn):DNA甲基化檢測(cè)具有早期、無創(chuàng)、快捷、靈敏度高等特點(diǎn)。(血液、粘膜上皮標(biāo)本)缺點(diǎn):特異性不足,表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記開發(fā),2017年3月,張鹍教授團(tuán)隊(duì)在Nature Genetics(NG)雜志發(fā)布了令人振奮的研究成果,利用更靈敏的算法配合組織甲基化

15、模式開發(fā)的無創(chuàng)診斷技術(shù),可以檢測(cè)并定位腫瘤。通過比較腫瘤和正常細(xì)胞的DNA甲基化數(shù)據(jù)找到腫瘤特異的甲基化Marker。,燃石醫(yī)學(xué)自主研發(fā)了無創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)(MERMAID?),運(yùn)用多層級(jí)甲基化探針設(shè)計(jì)策略,可實(shí)現(xiàn)在檢測(cè)成本可控的情況下同時(shí)檢測(cè)超過10萬個(gè)臨床診斷相關(guān)的甲基化CpG位點(diǎn),并通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法建立分類模型,實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)樣本自動(dòng)分型。 cfDNA無創(chuàng)甲基化檢測(cè)系統(tǒng)(MERMAID?) 用于肺部占位病變(含肺癌)

16、的早篩可實(shí)現(xiàn)99.6%的敏感性和100%的特異性,用于肺部結(jié)節(jié)良惡性判定可實(shí)84.8%的敏感性和87.5%的特異性。,cfDNA甲基化液體活檢技術(shù),應(yīng)用前景2--腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子,口腔鱗狀細(xì)胞癌時(shí)存在RECK基因甲基化的患者復(fù)發(fā)率明顯增高甲基化影響生存期膀胱癌中APC、GSTP1和TIG1基因發(fā)生異常甲基化時(shí),患者存活時(shí)間明顯縮短,LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK ge

17、ne predicts poor prognosis in oral squamous cell carcinomas[ J ]. Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058.ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cell - Free Serum DNA Indicates Worse Outcome in Patients With Bladder

18、 Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.,應(yīng)用前景3--腫瘤的去甲基化治療,DNA甲基化程度依賴于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用, DNMT1是DNMT3啟動(dòng)CpG核苷酸從頭甲基化的保證,而DNMT3則使甲基化水平穩(wěn)定在正常需要水平(去甲基化) —— 抑制DNMT活性藥物是治療腫瘤的新希望,優(yōu)點(diǎn):新型抗腫瘤藥物缺點(diǎn):無基因特異性,不能選擇性地

19、活化沉默的目的基因,從而會(huì)引起整體的低甲基化; 藥物的活化作用可逆,療效依賴于藥物的持續(xù)存在;大劑量應(yīng)用時(shí)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞有毒副作用,— 是否會(huì)誘發(fā)第二腫瘤?,應(yīng)用前景3--腫瘤的去甲基化治療,MGMT基因在許多腫瘤中被認(rèn)為是抗腫瘤藥物治療的預(yù)測(cè)標(biāo)記。MGMT啟動(dòng)子腫瘤特異性甲基化,可以抑制MGMT蛋白的活性,從而使得腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化類的抗腫瘤藥物敏感,因而被廣泛用于腫瘤化療治療。,Figure: Kaplan–Meier Estimat

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