DNA氧化在2型糖尿病腎損傷中的作用研究.pdf

1、對(duì)于DN的具體發(fā)病機(jī)制，還不是很明確。T2DM和DN患者機(jī)體DNA的氧化水平如何？DNA的氧化損傷在T2DM腎損傷中的作用如何？飲食中添加DHA會(huì)對(duì)T2DM腎臟中DNA的氧化水平有何影響？能否有效地緩解T2DM所引起的腎組織損傷？DHA又是通過(guò)何種分子機(jī)制對(duì)T2DM腎臟DNA的氧化損傷造成影響的呢？
　　本文主要分三部分展開(kāi)研究：
　　第一部分 DNA氧化損傷生物標(biāo)記物8-OHdG毛細(xì)管電泳分析新方法的建立
　　目的:

2、為下一步研究T2DM和DN患者機(jī)體的DNA氧化水平奠定方法學(xué)的基礎(chǔ)。
　　方法:固相萃取結(jié)合膠束毛細(xì)管電泳紫外檢測(cè)法。
　　結(jié)果:本研究建立了一種固相萃取結(jié)合膠束毛細(xì)管電泳檢測(cè)尿液中8-OHdG的新方法。通過(guò)優(yōu)化SPE萃取條件和MEKC分離條件，在最佳條件下，8-OHdG濃度在1到500μg L-1之間線(xiàn)性良好，LOD(S/N=3)為0.27μg L-1，LOQ(S/N=10)為0.82μg L-1。該方法檢測(cè)尿液中8-OH

3、dG的日間精密度和日內(nèi)精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.6％和4.3％，（健康兒童尿液加標(biāo)）回收率在99.8％～103.2％之間。該方法彌補(bǔ)了CE-UV在測(cè)定痕量組分方面的不足。
　　結(jié)論:建立了一種簡(jiǎn)單，靈敏，快速的檢測(cè)尿液中8-OHdG的新方法，為機(jī)體DNA氧化損傷水平的測(cè)量提供了一種新的途徑。
　　第二部分 DNA氧化水平與2型糖尿病腎損傷之間相關(guān)性的研究
　　目的:探討2型糖尿病患者腎損傷與DNA氧化的關(guān)系。

4、>　　方法:1.應(yīng)用第一部分新建的以及本室原有的毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法測(cè)定并分析CON組、T2DM組和DN組尿液中的8-OHdG和creatinine;2.對(duì)尿液中8-OHdG/creatinine比值與其他臨床生化指標(biāo)之間進(jìn)行person相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:DN組患者尿液中8-OHdG/creatinine（45.14±12.68μg/g）顯著高于CON組（11.72±2.38μg/g）和T2DM組（16.37±4.97μg/g

5、），尿液中8-OHdG/creatinine的水平與尿酸(UA)值無(wú)顯著相關(guān)性，與糖化血紅蛋白和24小時(shí)尿蛋白排泄量之間有顯著正相關(guān)性。
　　結(jié)論:DN組患者腎損傷與DNA的氧化有關(guān)
　　第三部分 DHA通過(guò)降低DNA氧化水平緩解2型糖尿病大鼠的腎損傷
　　目的:探討DHA是否可通過(guò)降低氧化應(yīng)激及DNA的氧化來(lái)改善T2DM的腎損傷。
　　方法:1.高脂飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)T2DM大鼠，并經(jīng)飲食補(bǔ)充DHA;2.利

6、用生物化學(xué)和病理學(xué)方法檢測(cè)大鼠腎臟功能相關(guān)的生化指標(biāo)和腎組織結(jié)構(gòu)，評(píng)價(jià)DHA對(duì)腎臟功能的影響;3.利用組織熒光和生物化學(xué)方法，測(cè)定大鼠腎臟組織的ROS水平、脂質(zhì)過(guò)氧化水平、DNA的氧化損傷，確定DHA能否改善T2DM腎臟組織的氧化應(yīng)激，脂質(zhì)過(guò)氧化以及DNA損傷;4.使用生物化學(xué)的方法檢測(cè)大鼠腎臟組織的重要抗氧酶活性和重要的抗氧物質(zhì)的含量，確定DHA對(duì)T2DM大鼠腎臟組織的抗氧化系統(tǒng)的影響;5.采用Real time PCR檢測(cè)飲食添加D

7、HA對(duì)T2DM大鼠腎臟三大抗氧化系統(tǒng)主要相關(guān)抗氧酶mRNA表達(dá)水平的影響;6.Western blot檢測(cè)飲食添加DHA對(duì)T2DM大鼠腎臟組織中NADPH氧化酶重要亞基的蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:1.DHA降低了T2DM大鼠24小時(shí)尿蛋白的排泄率
　　32周干預(yù)結(jié)束時(shí)，DM組大鼠的24小時(shí)尿蛋白排泄率(1893.9±948.8ng)顯著高于對(duì)照組（477.5±197.1 ng）（P＜0.05）;而DHA組大鼠的24小時(shí)

8、尿蛋白排泄率(1133.9±542.7 ng)明顯低于DM組（P＜0.05），但顯著高于CON組(P＜0.05)。
　　2.DHA改善了T2DM大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的損傷
　　H&E染色結(jié)果顯示:CON組大鼠腎臟未見(jiàn)明顯的腎組織病理學(xué)變化，腎小球邊緣齊整，結(jié)構(gòu)正常，分布較均勻，細(xì)胞核排列較為整齊，腎小管形態(tài)清晰。DM組大鼠腎小球分布不均勻，細(xì)胞核排布散亂，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，基質(zhì)彌漫性增多，腎小球體積增大，平均腎小球截面積明

9、顯高于CON組。DHA組介于以上兩者之間，較DM組有所改善。
　　3.DHA改善了T2DM大鼠腎臟組織的DNA損傷
　　3.1 DHA降低了T2DM大鼠腎小管內(nèi)8-OHdG的含量
　　腎臟組織石蠟切片免疫熒光結(jié)果顯示在腎小管內(nèi)8-OHdG的含量DM組明顯高于CON組和DHA組。說(shuō)明飲食中添加DHA可有效減少T2DM大鼠腎臟腎小管內(nèi)8-OHdG的生成。
　　3.2 DHA緩解了T2DM大鼠腎臟組織核DNA的凋亡。<

10、br>　　DM組腎臟組織切片TUNEL染色顯示凋亡的強(qiáng)度明顯高于CON組和DHA組，說(shuō)明飲食中添加DHA可有效緩解T2DM大鼠腎臟內(nèi)的細(xì)胞凋亡。
　　4.DHA降低了2型糖尿病大鼠腎臟組織的氧化應(yīng)激水平
　　4.1 DHA降低了2型糖尿病大鼠腎臟組織的ROS水平
　　DHE染色法和熒光分光光度檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果一致顯示:DM組大鼠腎臟組織中的ROS水平顯著高于CON組（P＜0.05）;而DHA組大鼠腎臟組織中的ROS水平

11、明顯低于DM組（P＜0.05），而與CON組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4.2 DHA降低了T2DM大鼠腎臟組織中NADPH氧化酶重要亞基在mRNA水平及蛋白水平上的表達(dá)
　　在高血糖條件下NADPH氧化酶可以誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS。Real time PCR結(jié)果顯示DHA可通過(guò)下調(diào)NADPH氧化酶的Nox2，Nox4和P22 phox亞基基因在mRNA水平上的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)糖尿病大鼠腎臟組織的抗氧化能力。
　　Wes

12、tern Blot結(jié)果顯示DHA可通過(guò)下調(diào)NADPH氧化酶的Nox2，Nox4，P22 phox和p-P47 phox亞基基因的蛋白表達(dá)水平來(lái)降低糖尿病大鼠腎臟組織的ROS水平。
　　5.DHA降低了T2DM大鼠腎臟組織脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量
　　5.1 DHA降低了T2DM大鼠腎臟組織脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的含量
　　MDA是膜脂質(zhì)過(guò)氧化的重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷程度。DM組腎臟組織勻漿液中MDA的含量

13、為(1.20±0.18nmol/mg prot)明顯高于CON組（0.86±0.13 nmol/mg prot）和DHA組（1.01±0.19 nmol/mg prot），說(shuō)明飲食中添加DHA可有效減少T2DM大鼠腎臟內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的生成。
　　5.2 DHA降低了T2DM大鼠腎臟組織腎小管內(nèi)4-HNE含量
　　在體內(nèi)4-HNE是n-6系多不飽和脂肪酸過(guò)氧化的產(chǎn)物，大鼠腎小管內(nèi)4-HNE的含量DM組顯著高于CON組和D

14、HA組;而腎小球內(nèi)4-HNE的含量，DM組和DHA組均顯著高于CON組，但DM組和DHA組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說(shuō)明飲食中添加DHA能夠有效抑制T2DM大鼠腎小管內(nèi)的n-6系脂肪酸的過(guò)氧化。
　　6.DHA提高了T2DM大鼠腎臟組織的抗氧能力
　　6.1 DHA提高了T2DM大鼠腎臟組織的總抗氧能力(T-AOC)
　　DM組腎臟組織勻漿液中T-AOC(1.03±0.23 U/mg prot)明顯低于CON組(1.39±

15、0.41 U/mg prot)和DHA組(1.31±0.28 U/mg prot)，說(shuō)明飲食中添加DHA可有效增加T2DM大鼠腎臟的總抗氧能力。
　　6.2 DHA提高了T2DM大鼠腎臟組織內(nèi)谷胱甘肽還原酶、過(guò)氧化氫酶和硫氧還蛋白還原酶等抗氧酶的活性
　　實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了三組大鼠腎臟組織勻漿液中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、過(guò)氧化氫酶、總超氧化物歧化酶和硫氧還蛋白還原酶等重要的抗氧酶的酶活性，結(jié)果顯示飲食中添加DHA可有效增

16、加T2DM大鼠腎臟內(nèi)谷胱甘肽還原酶、過(guò)氧化氫酶和硫氧還蛋白還原酶的活性。
　　6.3 DHA增加了T2DM大鼠腎臟組織內(nèi)谷胱甘肽的含量
　　結(jié)果顯示，DM組腎臟組織勻漿液中GSH的含量(0.0062±0.0035μM/gTissue)明顯低于CON組(0.0213±0.0049μM/g Tissue)和DHA組(0.0112±0.0037μM/g Tissue)，說(shuō)明飲食中添加DHA可以有效增加T2DM大鼠腎臟內(nèi)還原型谷胱甘

17、肽的含量。
　　6.4 DHA增加了T2DM大鼠腎臟組織內(nèi)4-HHE的含量
　　4-HHE是n-3系多不飽和脂肪酸（主要是DHA）過(guò)氧化的產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4-HHE在腎小球和腎小管內(nèi)的含量變化趨勢(shì)一致，DHA組的4-HHE含量顯著高于DM組和CON組。這說(shuō)明DHA可以作為抗氧劑通過(guò)自身氧化來(lái)降低腎臟組織的氧化損傷。
　　7.DHA可以上調(diào)SOD1、Gpx1和Gpx4-1等基因在mRNA水平上的表達(dá)。
　　結(jié)論: