2型糖尿病腎病腎小球內(nèi)的脂質(zhì)氧化損傷和氧化型低密度脂蛋白對足細(xì)胞的損傷作用.pdf

1、全世界范圍內(nèi)現(xiàn)已有一億七千萬糖尿病患者，預(yù)計到2010年，患病人數(shù)仍將增長50％，其中2型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)患者占總患病人數(shù)的90％左右，成為最為普遍的類型。由2型糖尿病引發(fā)的糖尿病腎病目前己成為西方國家終末期腎病最主要的原因，并隨著發(fā)病范圍的擴(kuò)大，也將成為許多發(fā)展中國家最為常見的終末期腎病原因，給世界各國帶來巨大的社會經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。 2型糖尿病表現(xiàn)為微量白蛋白尿和后繼發(fā)生的明顯的蛋白尿。已知腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)

2、胞在糖尿病腎病的發(fā)生起一定作用，近來的研究顯示腎小球足細(xì)胞在糖尿病腎病的早期階段就出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)的改變，在腎活檢組織和培養(yǎng)的足細(xì)胞中均觀察到了nephrin的表達(dá)下降。 有關(guān)糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理研究，近來關(guān)于氧化應(yīng)激的作用備受關(guān)注，線粒體產(chǎn)生的活性氧簇增多被認(rèn)為在引起糖尿病的并發(fā)癥中起重要作用?；钚匝醮乜稍隗w內(nèi)外氧化多種復(fù)合物，低密度脂蛋白因含有有較高量的多聚不飽和脂肪酸而較易為氧化。氧化型低密度脂蛋白與動脈粥樣硬化的進(jìn)展密切相關(guān)，

3、多數(shù)引起動脈粥樣硬化的因素也出現(xiàn)于腎小球內(nèi)，因此氧化型低密度脂蛋白在糖尿病腎病中可能起相似的作用。 活性氧簇的水平取決于其產(chǎn)生的量和機(jī)體抗氧化物質(zhì)的活性。過表達(dá)人的胞漿銅-鋅超氧化物歧化酶轉(zhuǎn)基因并誘發(fā)糖尿病的小鼠，其糖尿病的損傷程度顯著改善，這表明超氧化物歧化酶有抗糖尿病腎病中的氧化損傷作用。因此研究糖尿病腎病中的脂質(zhì)氧化損傷和抗氧化能力的改變無疑具有重要意義。 本研究旨在觀察2型糖尿病腎病腎活檢組織內(nèi)的脂質(zhì)氧化物和抗氧

4、化物的表達(dá)情況，足細(xì)胞的損傷情況，脂質(zhì)氧化損傷、抗氧化能力與腎功能、足細(xì)胞的變化以及其它臨床病理資料間的相關(guān)性，同時通過體外實(shí)驗(yàn)來觀察氧化型低密度脂蛋白對足細(xì)胞的損傷作用及機(jī)制。通過這些研究探討2型糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，為今后新的臨床治療策略提供重要理論基礎(chǔ)。在這領(lǐng)域經(jīng)國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索尚無系統(tǒng)深入的報道，因此本研究具有一定的創(chuàng)新性。 第一章2型糖尿病腎病中腎小球的脂質(zhì)氧化損傷和足細(xì)胞的改變 目的：觀察2型糖尿病腎病腎組織內(nèi)

5、的脂質(zhì)氧化和抗氧化現(xiàn)象、足細(xì)胞蛋白表達(dá)的改變，并與臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)分析，探討脂質(zhì)氧化損傷在2型糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用和意義。 方法：收集100腎活檢冰凍組織，其中20例原發(fā)性IgA腎病，20例原發(fā)性膜性腎病、20例原發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化，35例2型糖尿病腎病，所有病理診斷結(jié)果經(jīng)免疫熒光、光鏡和電鏡檢查后確定。5例正常腎組織經(jīng)大體和病理檢查均證實(shí)無腫瘤組織浸潤。其中入選的35例2型DN均為根據(jù)Mazzucco等分類方法

6、中的1型——糖尿病腎小球硬化型。 間接免疫熒光法觀察各組織中銅氧化修飾的低密度脂蛋白(Cu2+-ox-LDL)和超氧化物歧化酶-1(SOD-1)表達(dá)情況，35例DN腎組織進(jìn)行了Nephrin、Synaptopodin、ZO-1表達(dá)的檢測，由于DN活檢組織來源有限，其中10例DN腎組織和其它病理類型的腎組織和正常腎組織進(jìn)行了丙二醛(MDA)、4-羥基壬烯醛(4-HNE)、血紅素加氧合酶-1(HSP32)、熱休克蛋白60(HSP60

7、)的表達(dá)情況。 結(jié)果：所有正常腎組織中，除SOD-1在腎小球內(nèi)可見有較弱的表達(dá)外，腎小球內(nèi)脂質(zhì)氧化物、其余抗氧化物全部陰性。原發(fā)性腎小球腎炎的腎組織中，2例IgA腎病、2例MN腎小球內(nèi)分別有少量Cu2+-ox-LDL和MDA表達(dá)，其余55例(92％)腎組織中的腎小球內(nèi)與正常組織的表達(dá)情況相同。所有糖尿病腎病腎小球內(nèi)均有不同程度的Cu2+-ox-LDL沉積和SOD-1表達(dá)，大多沿著腎小球基底膜分布。10例檢測了MDA和4-HNE的

8、糖尿病腎病腎組織中腎小球內(nèi)的MDA和4-HNE也均陽性。糖尿病腎病足細(xì)胞nephrin的表達(dá)減少。 結(jié)合臨床病理資料分析，Cu2+-ox-LDL的沉積與糖尿病腎病患者的視網(wǎng)膜病變呈正相關(guān)(r=+0.46，P=0.01)，與其它臨床病理參數(shù)無相關(guān)性；隨Cu2+-ox-LDL在小球內(nèi)的沉積增加，足細(xì)胞nephrin的陽性表達(dá)率呈下降趨勢。SOD-1的表達(dá)與活檢時的血清肌酐水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.57，P=0.0007)，與肌酐清除率

9、呈正相關(guān)(r=+0.84，P=0.0000)，與腎間質(zhì)纖維化和浸潤程度負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.46和-0.37，P值分別為0.006和0.03)，并與足細(xì)胞蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，與nephrin的相關(guān)系數(shù)為r=+0.59(P=0.0001)，與synaptopodin的相關(guān)系數(shù)為r=+0.58(P=0.0001)，與ZO-1也呈正相關(guān)(r=+0.56，P=0.0001)，但與Cu2+-ox-LDL的表達(dá)無顯著相關(guān)性。2型糖尿病腎病足細(xì)胞的

10、nephrin表達(dá)陽性率降低(34.43％)，有nephrin表達(dá)的患者蛋白尿程度顯著低于無nephrin表達(dá)的患者(1.85±1.35vs3.67±3.80，t=2.064，p=0.048)。 結(jié)論：2型糖尿病腎病腎小球內(nèi)均存在脂質(zhì)氧化損傷，其中隨著Cu2+-ox-LDL在腎小球內(nèi)的沉積增多，足細(xì)胞蛋白nephrin的表達(dá)呈下降趨勢?？寡趸颯OD-1在2型糖尿病腎病的腎小球內(nèi)有不同程度的表達(dá)，表達(dá)程度與腎功能的改變和腎小球足

11、細(xì)胞蛋白的完整性密切相關(guān)。足細(xì)胞neprhin的表達(dá)與2型糖尿病腎病的蛋白尿程度有關(guān)。 第二章H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠腎小球足細(xì)胞株的分離、培養(yǎng)與鑒定 目的：利用H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠的條件永生性從腎臟中分離、純化和培養(yǎng)腎小球足細(xì)胞株。 方法：篩網(wǎng)法分離腎小球，免疫磁珠初步分離腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，限制性稀釋法從結(jié)合磁珠后的細(xì)胞中純化獲取單細(xì)胞克隆后持續(xù)傳代培養(yǎng)。間接免疫熒光法鑒定及篩選足細(xì)胞克隆，并

12、對足細(xì)胞進(jìn)行攝取Dil-LDL的功能檢測。 結(jié)果：分離純化后的細(xì)胞克隆在33℃有γ-干擾素誘導(dǎo)下具有無限增殖能力，37℃無γ-干擾素條件下細(xì)胞趨于分化成熟。所獲得的足細(xì)胞在33℃有γ-干擾素和37℃無γ-干擾素條件下均表達(dá)足細(xì)胞抗原WT-1，33℃不表達(dá)成熟足細(xì)胞抗原synaptopodin，37℃無γ-干擾素培養(yǎng)兩周后足細(xì)胞形成大量足突結(jié)構(gòu)并特異性表達(dá)成熟足細(xì)胞的標(biāo)志物nephrin和synaptopodin。33℃和37℃條

13、件下足細(xì)胞均有攝取Dil-LDL的功能。 結(jié)論：本研究成功建立了具有分化成熟足細(xì)胞特性的條件永生性小鼠足細(xì)胞株，為體外研究足細(xì)胞的功能及其在腎臟疾病中的作用提供了細(xì)胞株。 第三章氧化型低密度脂蛋白對足細(xì)胞的損傷作用及機(jī)制 目的：在體外觀察氧化型低密度脂蛋白對分化成熟的小鼠足細(xì)胞的作用，探討氧化型低密度脂蛋白損傷足細(xì)胞后的效應(yīng)和激活的信號通路，以及足細(xì)胞對氧化損傷刺激反應(yīng)后抗氧化能力的變化。 方法：硫酸銅氧

14、化法制備銅氧化修飾的低密度脂蛋白，分別用無血清培養(yǎng)液、50ug/ml氧化型低密度脂蛋白和低密度脂蛋白刺激小鼠足細(xì)胞，觀察12小時和24小時兩個時間點(diǎn)足細(xì)胞的損傷變化及其抗氧化物質(zhì)SOD活性的改變。TUNEL檢測足細(xì)胞的凋亡情況，間接免疫熒光法觀察足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin和細(xì)胞骨架蛋白paxillin、F-actin的表達(dá)；westemblot觀察nephrin表達(dá)的改變和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、糖原合成酶-3β(GSK-

15、3β)兩條信號通路的改變；分光光度法檢測足細(xì)胞胞漿的SOD活性。 結(jié)果：24小時足細(xì)胞未發(fā)生凋亡現(xiàn)象，12小時各組nephrin表達(dá)無差異，24小時氧化型低密度脂蛋白刺激組nephrin表達(dá)顯著降低，24小時氧化型低密度脂蛋白刺激組paxillin足突上的表達(dá)消失，F(xiàn)-actin重新分布。Westernblot的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，24小時nephrin在氧化型低密度脂蛋白刺激組的表達(dá)量顯著降低。12小時MAPK和GSK-3β的活性

16、無明顯變化，24小時磷酸化的MAPK和GSK-3β在氧化型低密度脂蛋白刺激組顯著增加。12小時氧化型低密度脂蛋白刺激的足細(xì)胞SOD活性較對照組增高19.94％，當(dāng)刺激持續(xù)至24小時，較同一時間點(diǎn)的對照組僅增高7.3％。 結(jié)論：氧化型低密度脂蛋白刺激體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞24小時后，引起nephrin表達(dá)下降，細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)，磷酸化的MAPK、GSK-3β比率增加，提示上述兩通路的激活可能是造成nephrin表達(dá)下降和細(xì)胞骨架蛋白