微生物檢測方法

1、1992、FDA《細(xì)菌分析手冊―需氧菌平板計數(shù)》，或15～300個（如ISO4833:1991《微生物學(xué)大腸桿菌菌落計數(shù)通用指南最大可能數(shù)技術(shù)》）等。菌落計數(shù)前先觀測菌落生長的情況，一般同一稀釋度的平板上的菌落數(shù)應(yīng)相近，不同稀釋度平板上的菌落數(shù)則應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比。蔓延菌落的生長會抑制其他菌株的生長，或者會覆蓋其他的小菌落，所以最好不要選擇有蔓延菌落生長的平板作為計數(shù)平板，但如必須選擇，應(yīng)在記錄中標(biāo)記清楚。如片狀菌落不到平板的一半，而其

2、余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界限），若只有一條鏈可視為一個菌落，如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個菌落計。當(dāng)每個稀釋度制備了兩塊平板時，用所選擇的平板的算術(shù)平均值來計算原始樣品中的微生物的含量。樣品的菌落數(shù)等于每克或每毫升的cfu值除以稀釋度。報告方式：空白對照實驗：2.2大腸菌群大腸菌群或稱總大腸菌群是指一群能在37℃條件下發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或

3、兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。符合這些條件的腸桿菌科細(xì)菌主要包括4個菌屬：埃希氏菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關(guān)的僅有一個種，即大腸桿菌；其次有檸檬酸桿菌屬，其代表種有弗勞地枸櫞酸桿菌；克雷伯氏菌屬，代表種為肺炎克雷伯氏菌；腸桿菌屬，代表種有陰溝桿菌和產(chǎn)氣桿菌。大腸菌群衛(wèi)生學(xué)意義：大腸菌群主要來源于人、畜糞便。大腸菌群是反映食品中是否存在糞便污染的指示菌，食品中有糞便污染，則可推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒

4、和流行病的威脅，同時也反映出被測食品對人體健康存在危害。大腸菌群檢測已被廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。檢驗的標(biāo)準(zhǔn)通常使用GBT4789.32003、SN016892檢驗中需了解和注意事項：1.挑選菌落在實際工作中，為了提高大腸菌群的檢出率，應(yīng)當(dāng)熟悉大腸菌群的菌落色澤和形態(tài)。在GBT4789.32003檢驗方法中規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤，檢出率為最高；紅色、粉色菌落檢出率較低。2.發(fā)酵管的產(chǎn)

5、氣量在日常工作中，有時在發(fā)酵倒管內(nèi)有極微小的氣泡（有時比小米粒還?。?，有時可遇到在初發(fā)酵時產(chǎn)酸未產(chǎn)氣，但在液面及管壁卻可以看到緩緩上浮的小氣泡。這種情況大腸菌群的陽性檢出率能達(dá)到30%50%。所以不能忽視產(chǎn)氣量少的，對未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗。3.抑菌劑大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑可抑制樣品中的—些

6、雜菌，特別是G的生長，而有利于大腸菌群的生長和挑選。GBT4789.32003中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，SN016892中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉（月桂基）作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。2.3金黃色葡萄球菌邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些

7、，外觀可能粗糙并干燥。3.1.5血漿凝固酶試驗:吸取1，4新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加人培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物o.5ml.，振蕩搖勻，置36℃士1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽性結(jié)果。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。3.2直接計數(shù)方法3.2.1吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行10倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度稀釋液1m

8、L，分別加入三塊BairdParker平板，每個平板接種量分別為0.3mL0.3mI.0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個平板。如水分多不易吸收，可將平板放在36℃士10C1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36℃士1℃培養(yǎng)。3.2.2在三個平板上點數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選五個菌落，分別接種血平板，36℃士10C24h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗，步驟同增菌培養(yǎng)法。3.2.3菌落計數(shù):將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加

9、，乘以血漿凝固酶陽性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。四鑒定試驗（1）血漿凝固酶試驗：本試驗是鑒定金黃色葡萄球菌致病性的重要試驗血漿凝固酶通常以兔血漿為最好，避免使用檸檬酸抗凝的血漿，以EDTA抗凝兔血漿為最好。取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗免血漿于8mmX100mm試管內(nèi)充分混合，置36士1℃培養(yǎng)，定時觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h。以內(nèi)容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時不流動者為陽性。試驗

10、中需同時做已知陽性和陰性對照。SN01721992中明確規(guī)定對可疑結(jié)果，應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和其他輔助試驗如耐熱核酸酶試驗等加以證實。(2）觸酶試驗：挑取菌落置于清潔玻片上，滴加3%H2O21～2滴，1min產(chǎn)生大量氣泡為陽性。(3）甘露醇發(fā)酵試驗：多數(shù)致病性葡萄球菌菌株發(fā)酵甘露醇。(4）耐熱核酸酶試驗：方法在SN01721992中附錄C。(5)SPA的檢測：SPA能與免抗羊紅細(xì)胞血清中的IgG的Fc段結(jié)合，使致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生凝集，A

11、蛋白的存在是金黃色葡萄球菌的特征。(6）新生霉素敏感試驗：每片含5μg，抑菌環(huán)＞16mm者為敏感，16mm者為耐藥。五腸毒素的測定方法在GBT4789.102003中。當(dāng)食品中檢出金黃色葡萄球菌時，表明食品加工處理衛(wèi)生條件較差，并不一定說明該食品導(dǎo)致了食物中毒。但當(dāng)食品中未分離出金黃色葡萄球菌時，也不能證明食品中不存在葡萄球菌腸毒素。2.4沙門氏菌沙門菌屬分類屬腸桿菌科，是腸桿菌科中最復(fù)雜的菌屬，是一種重要的腸道致病菌，可從人和世界各地