無菌工藝快速微生物檢測方法

1、無菌工藝快速微生物檢測方法無菌工藝快速微生物檢測方法自21世紀(jì)初以來，國際制藥工業(yè)界在無菌藥品生產(chǎn)領(lǐng)域開展了一項(xiàng)重要的檢測技術(shù)——快速微生物檢測（RMM，RapidMicrobiologicalMethods），包含快速檢出和鑒定。在多年制藥工業(yè)實(shí)踐中，許多實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)當(dāng)微生物養(yǎng)分被剝奪，或抗菌劑，如防腐劑、消毒劑、高溫蒸汽或去污染氣體的濃度達(dá)亞致死量時(shí)，微生物會發(fā)生應(yīng)激，無法在傳統(tǒng)人工介質(zhì)上復(fù)制培養(yǎng)。因?yàn)檫@種培養(yǎng)不能達(dá)到最佳復(fù)活條件，微

2、生物不能增殖。當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)，無菌培養(yǎng)陰性不能證明產(chǎn)品沒有受到污染。另外，無菌培養(yǎng)需時(shí)較長，不能實(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品生產(chǎn)過程中發(fā)生的污染，不能使產(chǎn)品快速放行，增加倉儲時(shí)間和成本。于是，人們希望開發(fā)出新的微生物檢查、定量和鑒定方法。近年來生物檢測技術(shù)高速發(fā)展并迅速向制藥領(lǐng)域滲透。當(dāng)前RMM各類技術(shù)平臺已經(jīng)能夠檢測到多種微生物及變異微生物；能明確樣品中微生物的數(shù)目；識別微生物的屬，種和亞種。這些技術(shù)主要分為基于微生物培養(yǎng)的快速發(fā)現(xiàn)和鑒定技術(shù)、活細(xì)

3、胞識別鑒定技術(shù)和基因及芯片識別鑒定技術(shù)?；谖⑸锱囵B(yǎng)的快速發(fā)現(xiàn)和鑒定技術(shù)基于微生物培養(yǎng)的快速發(fā)現(xiàn)和鑒定技術(shù)是在微生物培養(yǎng)過程中早期快速發(fā)現(xiàn)微生物生長。電阻監(jiān)測系統(tǒng)能測量微生物生長過程中液體介質(zhì)中電勢的變化。微生物生長過程中，較大的，不帶電的分子分解為較小的，高度帶電的分子，如蛋白質(zhì)變成氨基酸，脂肪變成脂肪酸，多糖變成乳酸等。通過監(jiān)測電極間離子移動（電導(dǎo)率）或電極表面電荷數(shù)量（電容），檢查是否有微生物生長。bioMrieuxBactom

4、eter系統(tǒng)就是基于這一原理。微生物液體培養(yǎng)時(shí)會產(chǎn)生CO2，在密閉容器中，可通過監(jiān)測容器中CO2含量的變化來檢測微生物生長。BacTALERT系統(tǒng)設(shè)備是bioMrieux的第二代技術(shù)。該技術(shù)將微生物生長產(chǎn)生的二氧化碳擴(kuò)散至液體乳膠傳感器，觸發(fā)顏色警報(bào)器，告知用戶檢測到微生物。GenzymeBiosurgery已將這種技術(shù)用于其細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品的快速無菌檢查。標(biāo)記活細(xì)胞。接著整個(gè)細(xì)胞表面進(jìn)行激光掃描，完成標(biāo)記微生物的定量測定。系統(tǒng)完成標(biāo)記和檢

5、測工藝大約需要90min。系統(tǒng)也可在數(shù)小時(shí)內(nèi)，利用抗體和核酸探針進(jìn)行特異微生物的檢測和定量測定。與傳統(tǒng)的介質(zhì)培養(yǎng)法相比，利用這種技術(shù)獲得的微生物數(shù)量更多，更適宜用于環(huán)境應(yīng)激類微生物即暴露在消毒劑或防腐劑中的微生物的檢測。基因及芯片識別鑒定技術(shù)基因識別鑒定是指利用基因擴(kuò)增和檢測平臺，包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、16SrRNA分析、基因測序等方法進(jìn)行的快速微生物檢測和鑒定。這些方法大多數(shù)用于檢測某種特異微生物是否存在

6、以及菌落的鑒別，可快速鑒定到屬、亞種和或系水平。這些方法需經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)得到起始原料，如瓊脂表面的一個(gè)菌落，因此獲得最終結(jié)果的時(shí)間包括細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是基因檢測的基本技術(shù)。利用小的DNA片段即引物，在TaqDNA聚合酶作用下，能使目標(biāo)序列進(jìn)行數(shù)百萬次復(fù)制，便于被檢測，用于確定樣品中是否存在某種特異微生物。PCR和MS結(jié)合用于檢測和鑒別微生物，可以非常準(zhǔn)確地知道每種含有DNA的底物的精確質(zhì)量，因此可通過質(zhì)譜對源于底物的P

7、CR目標(biāo)序列進(jìn)行高精度的測定。SequenomMassARRAY設(shè)備利用各種序列引物進(jìn)行微生物鑒別。序列包括看家基因（多位點(diǎn)序列分型MLST）和16SrDNA。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（TMA）采用單鏈RNA，通過T7RNA聚合酶，每個(gè)周期產(chǎn)生數(shù)千個(gè)RNA擴(kuò)增子，在15~30min內(nèi)可完成10億次復(fù)制，其效率遠(yuǎn)高于PCR。與PCR相比，利用TMA技術(shù)的其他優(yōu)勢還有：每個(gè)細(xì)胞只有唯一的DNA靶標(biāo)，卻有數(shù)千個(gè)rRNA復(fù)制品，提高了命中靶標(biāo)的可靠性；TM