kj05微生物快速檢測(cè)技術(shù)

1、8、微生物的快速檢測(cè),常見(jiàn)微生物檢測(cè)項(xiàng)目,常規(guī)微生物項(xiàng)目：細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、酵母總數(shù)、霉菌總數(shù)。致病微生物項(xiàng)目：沙門(mén)氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等。,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789 1-40：食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測(cè)定、大腸菌群計(jì)數(shù)、沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)、志賀氏菌檢驗(yàn)、致泄大腸埃希氏菌檢驗(yàn)、副溶血性弧菌檢驗(yàn)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)、空腸彎曲菌檢驗(yàn)

2、、金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)、溶血性鏈球菌檢驗(yàn)、肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)、產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)、蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)、常見(jiàn)產(chǎn)毒霉菌的鑒定、椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)、腸桿菌科噬菌體檢驗(yàn)、大腸菌群快速測(cè)定、雙歧桿菌檢驗(yàn)、乳酸菌檢驗(yàn)、大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn)、阪崎腸桿菌檢驗(yàn)等。,政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)為什么需要微生物快速檢測(cè)？,提高檢測(cè)效率節(jié)約人力資源成本與國(guó)際接軌,國(guó)內(nèi)外食品安全形勢(shì)嚴(yán)峻，惡性事件不斷發(fā)生

3、。歐洲“二噁英”、“瘋牛病”（20世紀(jì)90年代）日本大腸桿菌O157:H7中毒（1996）中國(guó)SARS（2003） 、東南亞國(guó)家禽流感（2004）美國(guó)菠菜大腸桿菌O157:H7污染事件（2006）,日益嚴(yán)峻的食品安全局勢(shì)的需要,企業(yè)為什么需要微生物快速檢測(cè)？,市場(chǎng)銷(xiāo)售環(huán)節(jié)要求快速出貨。尤其是一些保質(zhì)期較短的產(chǎn)品。減少物流的壓力，盡可能減少倉(cāng)存，加快資金周轉(zhuǎn)。節(jié)約人力資源成本（外資企業(yè)尤其突出）對(duì)于運(yùn)行HACCP質(zhì)量保證體系

4、的企業(yè)來(lái)說(shuō)，快速檢測(cè)方法尤其重要?？梢钥焖贆z測(cè)原料及半成品的污染情況，以采取相應(yīng)的措施控制最終產(chǎn)品的微生物超標(biāo)情況。,快速檢測(cè)方法勢(shì)在必行！！,國(guó)外許多政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)都在大量使用快速檢測(cè)方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和顯色培養(yǎng)基法在國(guó)外應(yīng)用相當(dāng)成功。國(guó)內(nèi)的許多政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)也都已經(jīng)在使用或正在考慮使用國(guó)外先進(jìn)的快速檢測(cè)技術(shù)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展趨勢(shì)來(lái)說(shuō)，快速方法是微生物檢測(cè)的一大方向。,一、常規(guī)微生物快速檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀,傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良法：1、

5、螺旋平板計(jì)數(shù)法：螺旋接種儀＋菌落計(jì)數(shù)2、濾膜法：常用于一些可過(guò)濾樣品的檢測(cè)。3、紙片法：培養(yǎng)基固定在載體上。省去制做培養(yǎng)基的時(shí)間。主要用于細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)。4、其它：如Simplate即用膠,改良MPN產(chǎn)品。,螺旋平板法,DWS螺旋平板接種儀,aColyte自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀,螺旋平板原理,,,,,平皿旋轉(zhuǎn),接種針往外移動(dòng)同時(shí)自動(dòng)將樣品稀釋1000倍,,,螺旋平板法的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 與傳統(tǒng)方法相比，無(wú)需稀釋3個(gè)梯度，每個(gè)梯度倒

6、2個(gè)平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點(diǎn)： 檢測(cè)時(shí)間并沒(méi)有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時(shí)。 需要配合自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，否則人工計(jì)數(shù)更麻煩。,濾 膜 法,濾膜法常用于可過(guò)濾樣品的微生物檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度增大，菌落無(wú)擴(kuò)散情況，便于計(jì)數(shù)。缺點(diǎn)：需要額外的支出購(gòu)買(mǎi)真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過(guò)程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對(duì)菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。,皿膜法—以紙片法為代

7、表,優(yōu)點(diǎn)：無(wú)需制備培養(yǎng)基，攜帶方便，非漫延菌落計(jì)數(shù)較方便。缺點(diǎn)：不能節(jié)省檢測(cè)時(shí)間。檢測(cè)成本相對(duì)偏高。大腸菌群紙片存在與MPN法無(wú)法對(duì)應(yīng)的問(wèn)題，金黃色葡萄球菌紙片存在取樣量太低的問(wèn)題。目前僅細(xì)菌總數(shù)紙片有一些用戶。,紙片法是目前被廣泛接受的方法。國(guó)標(biāo)餐具大腸菌群采用的就是紙片法。,其它即用膠，MPN改良法,Simplate,colilert,主要用于水樣或澄清樣品的大腸菌群或大腸桿菌檢測(cè),SimPlateTMTPC 法：基于食源性細(xì)菌的

8、蛋白質(zhì)有特異性酶類(lèi)，TPC培養(yǎng)基內(nèi)含有多種細(xì)菌酶類(lèi)所對(duì)應(yīng)的底物。檢樣被細(xì)菌污染時(shí)，只要具有一種酶的活性即能與底物作用生成4-甲基傘形酮，培養(yǎng)24h后，在紫外線照射下，發(fā)出藍(lán)色熒光。食源性細(xì)菌懸浮于TPC培養(yǎng)基表面，在分隔的小池內(nèi)能迅速進(jìn)行生化反應(yīng)，若有檢樣顆粒亦無(wú)干擾；它不是由48h形成的菌落來(lái)計(jì)數(shù)，而是24h后在紫外燈照射下記錄培養(yǎng)皿內(nèi)能發(fā)出藍(lán)色熒光的陽(yáng)性池?cái)?shù)，進(jìn)而由最大近似值(MPN) 表查出細(xì)菌的MPN。陽(yáng)性池?cái)?shù)與MPN 呈松泊

9、分布。,固定底物技術(shù)酶底物法，需要coliert試劑采用大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生D-半乳糖苷酶分解ONPG（鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）使培養(yǎng)液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產(chǎn)生D-葡萄糖醛酸酶分解MUG（4-甲基傘形酮-D-葡萄糖醛酸苷 ）使培養(yǎng)液在波長(zhǎng)366nm紫外光下產(chǎn)生熒光的原理，來(lái)判斷水樣中是否含有大腸菌群及大腸埃希氏菌。只需24小時(shí)即可同時(shí)定量出水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌的MPN值。,二、常規(guī)微生物快速檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀,快速檢測(cè)微生物

10、數(shù)量的新方法：1、ATP法：目前產(chǎn)品較多，如CHARM，Biotrace, …..等。2、電化學(xué)法：Sy-Lab公司Bactrac 4300，Tempo,…3、顏色變化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的MicroFoss。4、流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測(cè)量法,表面潔凈的檢測(cè)方法,微生物學(xué)法：紙片、瓊脂板、棉簽拭子、海綿拭子非微生物學(xué)法（快速法）：ATP(三磷酸腺苷，蛋白質(zhì), 降解糖、NADP(

11、輔酶II)，其它。,ATP---三磷酸腺苷,ATP來(lái)源于,細(xì)菌酵母 霉菌生物膜組織殘留,廢棄物污染人的污染,（一）ATP法,1. 人接觸設(shè)備或器具2. 設(shè)備或器具被污染3. 清洗不正常4. 非正常的敏感物污染5. 微生物污染,ATP 存在表明什么？,檢測(cè)原理,熒光素,熒光素酶,,,腺苷一磷酸,氧合熒光素,,,熒光,,ATP法兩大用途,1、用于食品、化妝品和藥品企業(yè)對(duì)生產(chǎn)線和管道進(jìn)行快速清潔程度檢測(cè)。政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)用ATP

12、方法缺乏法律依據(jù)。ATP法與微生物數(shù)量沒(méi)有必然的聯(lián)系。2、改良后用于食品、化妝品的商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)或終產(chǎn)品檢驗(yàn)。,LUM－T清潔程度快速檢測(cè),1)將水樣在玻璃纖維過(guò)濾器上過(guò)濾以便富集微生物；2)用適當(dāng)?shù)娜芙鈩┤芙饧?xì)胞；3)用適當(dāng)?shù)妮腿┹腿TP；4)將ATP的萃取液加到盛有螢光素、螢光素酶的試管中，并用光度計(jì)記錄下所產(chǎn)生光的量，將此讀數(shù)和ATP濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，就可得到待測(cè)樣品中ATP含量；用得到的ATP含量確定水樣中細(xì)菌數(shù)量。

13、,LUM-T的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),CHEF 熟肉制品成熟度檢驗(yàn)MicroQ 水中微生物污染程度檢測(cè)Cidelite 殺蟲(chóng)劑殘留初篩Paslite 牛奶巴氏消毒效果Somalite 體細(xì)胞計(jì)數(shù)SL/MRL test 抗生素殘留檢測(cè)（連接ROSA　imager),Charm ATP 檢測(cè),基于ATP原理的用于成品檢測(cè)的微生物檢測(cè)系統(tǒng),Charm　LUM-96 （用于UHT產(chǎn)品-高溫瞬間滅菌）BiotraceCelsis（主要用于化妝品

14、）Millipore公司的MicroScan,Celsis和LUM-96,保溫2天，檢測(cè)30分鐘（96個(gè)樣）,ATP法檢測(cè)成品的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：LUM-96通常用于進(jìn)行商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)?？纱蟠罂s短庫(kù)存時(shí)間，減少物流壓力和成本。缺點(diǎn)：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對(duì)儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，客戶通常懷疑假陰性的可能，特別是用ATP單個(gè)檢測(cè)代替常規(guī)微生物和致病微生物檢測(cè)，其風(fēng)險(xiǎn)是一定存在的。(如保溫增菌時(shí)間不夠，菌數(shù)未達(dá)到一定

15、數(shù)量，取樣量太小，由于培養(yǎng)基原因，目標(biāo)致病菌未大量增菌等原因),Millipore公司最新推出的MicroStar,,MicroStar的原理及局限性,MicroStar快速微生物檢測(cè)系統(tǒng)是結(jié)合了生物熒光、膜過(guò)濾及CCD熒光照相檢測(cè)等技術(shù)的新型檢測(cè)系統(tǒng).可過(guò)濾樣品經(jīng)膜過(guò)濾后，將菌截留在特殊的濾膜上，濾膜放置在培養(yǎng)基表面增菌后取出，加ATP釋放劑，然后加熒光素和熒光素酶，顯示的熒光信號(hào)在熒光顯微鏡或熒光檢測(cè)器下觀察并計(jì)數(shù)。,MicroS

16、tar的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高靈敏度。適合于菌數(shù)較低的可過(guò)濾產(chǎn)品使用。缺點(diǎn)：儀器較昂貴，運(yùn)行成本也非常貴。不能用于檢測(cè)未知的可能菌數(shù)較高的樣品(不知稀釋多少倍，因菌數(shù)必須稀釋至80個(gè)左右)。整個(gè)檢測(cè)時(shí)間還不夠快，通常需16小時(shí)以上。,（二）電化學(xué)方法(電導(dǎo)率法或電阻抗法),奧地利Sylab公司的Bactrac4300和Biotrac4200梅里埃公司的Bactometer和Tempo英國(guó)Multhus公司(已倒閉)英國(guó)

17、DWS公司的Rabit……,外觀比較,Bactrac4300,梅里埃的BactoMeter,DWS公司的Rabit,馬色斯120,世界上最好的電化學(xué)微生物快速檢測(cè)產(chǎn)品Bactrac 4300系統(tǒng),Sy-lab —Bactrac4300常規(guī)微生物項(xiàng)目快速檢測(cè)技術(shù),MicroFoss(Biosys) 微生物自動(dòng)監(jiān)測(cè)儀,微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)底部瓊脂層的顏色變化，記錄達(dá)到突變點(diǎn)的時(shí)間。,Microfo

18、ss的特點(diǎn),與阻抗法類(lèi)似，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。缺點(diǎn)：需要購(gòu)買(mǎi)原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。因此在我國(guó)目前還沒(méi)有用戶。,梅里埃的BacT/Alert微生物檢測(cè)儀,基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測(cè)反射光的強(qiáng)度。光強(qiáng)度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。,方法較新，用戶還需要一個(gè)過(guò)程了解。,流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù),用于非過(guò)濾產(chǎn)品,流式細(xì)胞 : 線性流體 單細(xì)胞分析

19、 靈敏的檢測(cè)頭,流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的技術(shù),（三）流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù),FOSS公司BactoScan FC牛奶中總菌數(shù)快速檢測(cè)儀,采用流式細(xì)胞原理。對(duì)微生物進(jìn)行核酸染色，用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),BactoScan FC的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：速度快(50-150樣品/小時(shí))缺點(diǎn)：死活細(xì)胞一起檢測(cè)，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企

20、業(yè)檢測(cè)原奶中細(xì)菌總數(shù)。,美國(guó)Chemunex公司微生物快速檢測(cè)系統(tǒng),美國(guó)Chemunex公司將流式細(xì)胞技術(shù)與活細(xì)胞熒光探針標(biāo)記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測(cè)儀。其最大的特點(diǎn)是只檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，速度極快，處理量大。與FOSS的BactoScan FC檢測(cè)死活細(xì)胞都檢測(cè)不同。是目前國(guó)際上正在認(rèn)可的生物熒光定量檢測(cè)微生物數(shù)量的兩種方法之一。另一種是

21、Millipore的一款叫MicroStar的基于ATP檢測(cè)的產(chǎn)品。,熒光酶標(biāo)記原理,直接單細(xì)胞標(biāo)記 (包括孢子) 細(xì)胞無(wú)增菌要求標(biāo)記在90分鐘內(nèi)完成直接對(duì)活細(xì)胞和酵母進(jìn)行標(biāo)記,標(biāo)記的細(xì)菌,標(biāo)記后的酵母,標(biāo)記后的霉菌,ChemScan RDI,三個(gè)簡(jiǎn)單的步驟,2. 標(biāo)記,3. 激光掃描,1. 過(guò)濾,,檢測(cè)步驟 - TVC,,1. 過(guò)濾,2. 標(biāo)記,3. 激光掃描,,樣品過(guò)濾,預(yù)標(biāo)記60 min,濾膜轉(zhuǎn)移,,ChemScanRDI

22、 ? 儀器分析,,標(biāo)記30 min,,,,,ChemScanÒ RDI 主機(jī),激光掃描分析儀3 分鐘分析時(shí)間結(jié)果直接顯示細(xì)胞個(gè)數(shù),,Laser scanning,Microscope Confirmation,Bactiflow,適合實(shí)驗(yàn)室或研究用日處理量不大于40個(gè)樣品,D－Count,適合實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)使用日處理量大于40個(gè)樣品的場(chǎng)合,,標(biāo)記和檢測(cè)原理,,Enzyme,Viability substrate,,

23、Free fluorochrome,,Micro-organism,Detector,Detector,Laser,Flow Cell,細(xì)胞標(biāo)記 12 minutes,細(xì)胞計(jì)數(shù) 1 minute,,自動(dòng)吸樣 無(wú)需預(yù)處理 每批可做64 個(gè)樣，含陰性和陽(yáng)性質(zhì)控,最小的人力要求,全自動(dòng)標(biāo)記和過(guò)濾 加所有要求的標(biāo)記試劑 控制溫育時(shí)間和溫度 去除大的顆粒 (25 µm尼龍網(wǎng)過(guò)濾),快速敏感的分析 每小時(shí)5

24、0個(gè)樣品 直接按 個(gè)/mL顯示結(jié)果,數(shù)據(jù)處理,區(qū)分微生物和顆粒的功能強(qiáng)大產(chǎn)品應(yīng)用范圍廣增強(qiáng)靈敏度直接顯示細(xì)胞數(shù)無(wú)需數(shù)據(jù)解釋直觀易讀完整的數(shù)據(jù)追溯性易于確證,三種型號(hào)的差異,√,√,哪些類(lèi)型客戶可以使用？,大型食品、化妝品、藥品企業(yè)，對(duì)快速檢測(cè)速度及樣品處理量要求高。目前儀器非常貴，運(yùn)作成本與免疫法相似。,三、致病菌快速檢測(cè)方法,顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假

25、陽(yáng)性存在，陽(yáng)性結(jié)果需要確認(rèn)。通常的原理有EIA（酶聯(lián)免疫），ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)），GLISA（夾心酶聯(lián)免疫吸附法 ），熒光酶免、免疫磁分離等方法。市場(chǎng)上的產(chǎn)品多，如BioMeriux,Tecra, Neogen,Biocontrol, Matrix等。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測(cè)法和PCR法為主?；蛐酒貉芯繜狳c(diǎn)。,致病微生物快速檢測(cè)產(chǎn)品,免疫磁分離法— Matrix公司的Pathatrix致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng),ELIS

26、A方法—澳洲TECRA公司的免疫捕獲快速檢測(cè),分子生物學(xué)方法(基因探針及PCR方法),GLISA---膠體金免疫層析致病菌快速檢測(cè)條,熒光酶免—Vidas系列產(chǎn)品(略),顯色培養(yǎng)基– 法國(guó)AES公司,GLISA－膠體金免疫層析檢測(cè)條,氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。膠

27、體金檢測(cè)條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使用簡(jiǎn)便。關(guān)鍵是制備單克隆抗體，然后與膠體金交聯(lián)，在親水紙層析條上固定。膠體金微生物檢測(cè)條在國(guó)內(nèi)已經(jīng)有不少產(chǎn)品，但用戶并不多，主要是質(zhì)量不穩(wěn)定。外來(lái)的膠體金微生物檢測(cè)產(chǎn)品比較多。,（一）免疫學(xué)方法,常見(jiàn)的膠體金檢測(cè)條舉例,大腸桿菌O157,李斯特氏菌,沙門(mén)氏菌,膠體金檢測(cè)條的優(yōu)缺點(diǎn),膠體金檢測(cè)方法屬于免疫檢測(cè)法，檢測(cè)的是死菌和活菌。一般需要增菌過(guò)夜。增菌后的檢測(cè)非常簡(jiǎn)單，約10分鐘一般

28、能完成。無(wú)需專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)儀器。進(jìn)口的檢測(cè)條的價(jià)格比較高，通常要30－90元。,（二）分子生物學(xué)方法,基因探針?lè)癙CR方法在國(guó)外已經(jīng)有相當(dāng)成熟的表現(xiàn)。有普通PCR，熒光PCR，實(shí)時(shí)熒光PCR（定量PCR）等多種方法?；蛱结?lè)ㄒ话阋残枰鼍?，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測(cè)器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長(zhǎng)時(shí)間，通過(guò)PCR方法對(duì)待測(cè)微生物的特征片斷進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過(guò)凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果。,分子生物學(xué)

29、方法應(yīng)用前景,試劑盒開(kāi)發(fā)相對(duì)比較容易。只要找出特征的基因片斷，合成出引物即可。目前客戶比較關(guān)注的致病菌，包括沙門(mén)氏、李斯特氏、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、霍亂弧菌、志賀氏菌等均有PCR試劑盒供應(yīng)。,常見(jiàn)的基因探針?lè)椒ɑ騼x器,BAXGene-trakGen-probeVermicon……,分子生物學(xué)方法病原菌檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn),分子生物學(xué)方法檢測(cè)致病菌，特異性較強(qiáng)，技術(shù)較為前沿，特別是相對(duì)國(guó)標(biāo)方面來(lái)說(shuō)。但國(guó)外用戶反映其假陽(yáng)性概

30、率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結(jié)果，與免疫法比沒(méi)有速度優(yōu)勢(shì)目前不少產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)AOAC的認(rèn)證。,（三）顯色培養(yǎng)基技術(shù),用顯色培養(yǎng)基鑒定微生物是一種新的微生物快速檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)以生化反應(yīng)為基礎(chǔ), 通過(guò)在培養(yǎng)基中加入細(xì)菌特異性酶的顯色底物直接根據(jù)菌落顏色對(duì)菌種作出鑒定。常見(jiàn)食源性致病菌檢測(cè)中, 李斯特菌顯色培養(yǎng)基(BCMTM L isteria m onocy togenes, Rap i

31、d’LMONO agar, CHROMagarTM L isteria) 、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagarTM Ecoli) 、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基(Rambach agar) 、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagar S taphy lococcusaureus) 等已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域, 極大提高了微生物檢測(cè)的效率。但是, 顯色培養(yǎng)基也存在一些假陽(yáng)(陰) 性等問(wèn)題, 其設(shè)計(jì)尚待優(yōu)化。,大腸桿菌顯色培養(yǎng)

32、基,利用大腸桿菌( Escherichia coli)特異性酶檢測(cè)鑒定大腸桿菌已十分普遍, 大約96%～98%的大腸桿菌產(chǎn)生β2D2葡萄糖苷酸酶(β2D2Gud) , 絕大部分沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和耶爾森氏菌不能產(chǎn)生Gud, 因此利用Gud酶底物可以有效的檢測(cè)大腸桿菌。目前開(kāi)發(fā)的顯色培養(yǎng)基常用酶底物有: 52溴242氯232吲哚2β2D2葡萄糖苷酸(X2Gluc) 、鄰硝基酚β2D葡萄糖苷酸(PNPG) , 底物被Gud水解后產(chǎn)生顯色物

33、質(zhì)使菌落呈現(xiàn)特殊的藍(lán)色或黃色。法國(guó)科瑪嘉CHROMagar Ecoli是目前應(yīng)用較廣泛的大腸桿菌顯色培養(yǎng)基, 在這種培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后, 大腸桿菌呈現(xiàn)藍(lán)色菌落。,沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基,沙門(mén)氏菌( Salmonella spp.)也是一類(lèi)重要的食源性致病菌, 常規(guī)分離鑒定需要非選擇性預(yù)增菌、選擇增菌、選擇分離平板鑒定等步驟, 操作十分繁瑣。德國(guó)Merck公司生產(chǎn)的顯色培養(yǎng)基Rambach agar以丙烯乙二醇和52溴242氯232吲哚2β

34、2D半乳糖吡喃糖苷酸(X2GAL) 為底物檢測(cè)沙門(mén)氏菌, 沙門(mén)氏菌能水解乙二醇產(chǎn)酸, 不能水解X2GAL, 在培養(yǎng)基上產(chǎn)生特殊的紅色菌落。臨床檢測(cè)結(jié)果表明其效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基BS、SS, 且假陽(yáng)性率較低。,金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基,金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)也是重要的食源性致病菌, DNA酶和凝固酶是其重要的標(biāo)志酶。以甲苯胺藍(lán)、甲基綠、丫啶橙和52溴242氯232吲哚2胸苷232磷酸等為顯色底物(如

35、CHROMagar S taphylococcus aureus) 或以D2phe2p ro2arg2β奈胺為底物都能有效檢測(cè)鑒定金黃色葡萄球菌。法國(guó)CHROMagar公司和瑞士Fluck公司都已研制出檢測(cè)該菌的顯色培養(yǎng)基并廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生行業(yè)。,李斯特菌顯色培養(yǎng)基,李斯特菌( Listeria spp.)是一類(lèi)個(gè)體較小的革蘭氏陽(yáng)性桿菌, 包括7個(gè)種, 其中只有單增李斯特菌(L.1monocytogens) 和綿羊李斯特菌(L.1iv

36、novii) 具有致病性。綿羊李斯特菌是動(dòng)物致病菌, 被列為90年代4大致病菌之一, 是食品衛(wèi)生行業(yè)的常檢致病微生物。近年來(lái), 許多國(guó)家致力于李斯特菌顯色培養(yǎng)基的研究, 針對(duì)李斯特菌特有的肌醇磷酸磷脂酶( PI2PLC) 和β2D2葡萄糖苷酶(β2D2glucosidase) 設(shè)計(jì)顯色底物對(duì)李斯特菌進(jìn)行快速檢測(cè)。,微生物 菌落顏色單增李斯特氏菌 綠色菌落，周?chē)袝炄d陽(yáng)李斯特氏菌

37、 綠色菌落，周?chē)袝炄τ⒅Z克李特氏菌 綠色菌落,其他顯色培養(yǎng)基,大腸桿菌O157:H7顯色培養(yǎng)基,微生物 菌落顏色大腸桿菌O157:H7 紫紅色其他大腸桿菌 藍(lán)色其他 無(wú)色或被抑制,阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基,微生物 菌落顏色阪崎腸桿菌 藍(lán)綠色大腸菌群 無(wú)色菌落金黃色葡萄球菌 被抑制,弧菌顯色培養(yǎng)基,微生物