2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、在本實驗中,我們選擇乳化揮發(fā)交聯法制備了多西他賽白蛋白納米粒(docetaxel albumin nanoparticles,DANPs)和PEG化多西他賽白蛋白納米粒(docetaxel loadedPEG-albumin nanoparticles,PEG-DANPs)。然后我們研究了DANPs和PEG-DANPs的表征,并進行了體外方面的一系列研究,包括:體外溶血反應、體外釋放及其對人非小細胞肺癌A549細胞的抑制增殖、誘導凋亡和

2、攝取的情況;在體內方面,我們分別建立了人非小細胞肺癌移植瘤及原位癌模型,分別研究了Aisu(@)、DANPs和PEG-DANPs三種藥物對移植瘤模型瘤塊抑制及體重減輕情況及藥物對原位癌裸鼠的抗瘤及抗轉移等情況,結果證明,PEG-DANPs對于NSCLC是一種十分安全、有效的治療藥物制劑。
  實驗方法和結果:
  1.乳化揮發(fā)交聯法制備PEG化多西他賽白蛋白納米粒(PEG-DANPs)
  DTX原料藥溶于氯仿和乙醇中

3、,白蛋白溶于無菌水中,將兩者混合后移至高壓乳均機內,20000 psi下進行乳化12個循環(huán),將所得的溶液放入旋轉蒸發(fā)器內使氯仿迅速除去,最終得到具有藍色乳光的半透明狀分散液,經冷凍干燥機凍干,復溶后過0.22μm膜,制成DANPs。
  DANPs溶于硼酸緩沖液,再加入mPEG(20000 kDa),在室溫下于攪拌儀中反應3h,最后加入甘氨酸(11mg/mL)終止反應。將反應物移至70 kDa透析膜中旋轉過濾半小時后冷凍,合成物干

4、燥備用。復溶后DANPs和PEG-DANPs用碘染色及考馬斯藍染色,進行PAGE膠電泳,結果顯示PEG-DANPs合成成功。
  2.動態(tài)光散射法測定DANPs和PEG-DANPs的粒徑和電位
  DANPs及PEG-DANPs凍干劑復溶,利用Malvern Nano ZS激光粒度分析儀測定其粒徑及電位。DANPs粒徑為163.4±3.76 nm,zeta電位平均為-19.4±0.18 mV;PEG-DANPs粒徑為169.

5、19±2.36 nm,zeta電位平均為-18.2±0.21 mV,說明兩種納米顆粒大小合適,電位合理。
  3.Hitachi H-7650電子顯微觀察DANPs和PEG-DANPs的形態(tài)
  DANPs及PEG-DANPs凍干劑復溶,取10μL滴在蠟塊表面,另取表面膜化處理的銅網正面朝下覆于液滴上,放置10 min后取下銅網,用濾紙吸干銅網表面液體,取1%磷鎢酸溶液負染色10 min,取下銅網置于燈下烤干,透射電鏡下觀察

6、載藥納米粒的顯微形態(tài)。在透射電鏡下觀察發(fā)現DANPs及PEG-DANPs顆粒大小均勻,形狀接近規(guī)則的圓球形。
  4.高效液相色譜法和(HPLC)和高速離心法測定DANPs和PEG-DANPs的載藥量和包封率
  DANPs及PEG-DANPs凍干劑加入適量的乙腈復溶,采用HPLC法測定DANPs及PEG-DANPs中的藥物含量。DANPs的包封率為93.58±0.86%,載藥量為8.71±0.98%;PEG-DANPs的包

7、封率為95.4±5.5%,載藥量為8.72±1.05%。
  5.藥物體外釋放實驗評價三種藥物及制劑的釋放特點
  Aisu(@)、DANPs及PEG-DANPs分別配置成5 mg/mL的溶液,加入孔徑為10kD的透析袋中,兩端扎緊后將透析袋置于40 mLPBS緩沖液中恒溫振蕩。在一系列時間點取出樣品0.2 mL透析液,同時補充0.2 mL透析液,在透析完成后將透析袋剪破,攪拌均勻,作為時間無窮大時的藥物釋放量。使用HPLC

8、法測定濃度,分別繪制出三種體外藥物釋放曲線。根據所繪體外釋放曲線所示,Aisu(@)在2小時時已經基本完全釋放,而DANPs和PEG-DANPs兩種制劑釋放均比較平緩,無突釋現象,反映出藥物白蛋白納米粒的穩(wěn)定性以及釋放的緩釋性。另外,PEG-DANPs較DANPs的釋放更加平緩,在血漿中的滯留時間更長,緩釋效應更加突出。
  6.藥物體外溶血實驗評價三種藥物及制劑對機體紅細胞的破壞情況
  取新鮮豚鼠血除去纖維蛋白后,加0.

9、9%生理鹽水離心洗滌直至上清液不再顯示紅色為止,加入5%葡萄糖注射液配制成2%(v/v)的紅細胞混懸液。取Aisu(@),DANPs以及PEG-DANPs制劑;另取同體積新鮮蒸餾水作為陽性對照組;取同體積5%葡萄糖注射液作為陰性對照組,向上述各管中分別加入同體積的2%紅細胞混懸液,置37℃的水浴1h后取出試管以2000 rpm離心5 min,吸取上清液在576 nm處測定各管溶液的吸收度計算各試驗管樣品的溶血度值。結果顯示,與Aisu(

10、@)和DANPs進行比較,在不同濃度下,PEG-DANPs的溶血程度均有所下降,提示其對機體紅細胞的破壞作用最小。
  7.三種藥物及制劑體內藥代動力學的研究
  12只健康雄性豚鼠隨機分為3組,每組4只,分別尾靜脈注射Aisu(@)、DANPs和PEG-DANPs(20mg/kg)。于特定時間點各取血0.5 mL,置于肝素化的離心管中,離心(4000 rpm,10 min),分離血漿,放入-20℃冰箱避光保存,利用HPLC

11、測定并計算藥代動力學參數。結果顯示,PEG-DANPs與Aisu(@)及DANPs組比較,在t1/2、AUC、 Cl均有顯著性差異,說明PEG-DANPs較Aisu(@)及DANPs在體內循環(huán)時間更長,具有更長的生物半衰期和體內滯留時間。
  8.MTT法測定三種藥物及制劑對A549細胞增殖抑制情況
  A549細胞培養(yǎng)至對數生長期,以8×103個/孔加入96孔板,培育24h后,分別加入PBS液(陰性對照組)、Aisu(@)

12、、DANPs、PEG-DANPs,藥物濃度依次為0μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h。吸棄舊培養(yǎng)基后加入20μL MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4小時,再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液,低速振蕩10 min,測定在490 nm處的吸光度值,記錄結果,計算不同藥物濃度下細胞增殖抑制率并軸繪制細胞生長曲線。結果顯示,三種藥物都對A549細胞

13、表現出相同的濃度-時間依賴型細胞毒性。在高濃度(1-100μg/mL)時,Aisu(@)制劑比DANPs和PEG-DANP納米粒制劑抑制癌細胞增殖的能力更強;而在正常和低濃度區(qū)間(0.001-0.1μg/mL)時,納米粒制劑對于對于癌細胞增殖的抑制要高于Aisu(@)。存72小時,Aisu(@)制劑由于在血液中已經幾乎檢查不到血藥濃度,因此,對細胞的抑制率也幾乎難以測出。
  9.流式細胞技術測定三種藥物及制劑對A549細胞誘導凋

14、亡的情況
  取對數生長期A549腫瘤細胞,以1×105個/瓶傳代培養(yǎng)至4個25cm3培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)生長至密度60%時加入對照組(空白培養(yǎng)基)、Aisu(@)、DANPs和PEG-DANPs進行干預,收集各組細胞,加Buffer結合液混勻,吹打均勻。室溫避光操作,加FITC混勻后,再加PI,室溫避光反應30min。立即上機檢測。根據結果可知,隨著對照組、Aisu(@)、DANPs和PEG-DANPs藥物的不同,在48小時這個特定時間

15、點上,右上象限(An+PI+)及右下象限(An+PI-)之和,即早凋、晚凋細胞和壞死細胞所占比例逐漸增多,分別為2.86%、25.85%、45.00%及50.65%,提示用藥組比對照組均能更顯著地誘導細胞凋亡,而在三者之間,PEG-DANPs較DANPs及Aisu(@)更能夠誘導肺癌A549細胞的凋亡,即PEG-DANPs誘導細胞凋亡的能力是最強的。
  10.激光共聚焦顯微鏡觀察DANPs和PEG-DANPs入胞情況
  

16、收集對數生長期的A549細胞接種于鋪有細胞爬片的6孔板內,培養(yǎng)24h待細胞貼壁生長后,加入已制備好的DANPs和PEG-DANPs,將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在達到特定時間點時,用鑷子將細胞爬片取出,用冷PBS緩沖溶液清洗3次后放在4%的多聚甲醛中固定。然后取出爬片倒置在載玻片上,用50%的甘油封片。在488 nm波長的激發(fā)光條件下,用共聚焦顯微鏡觀察。香豆素6在488nm激光激發(fā)下顯綠色熒光,比較它們之間的鏡下情況,隨著制劑的不同,熒

17、光攝取強度也逐漸增大,結果顯示PEG-DANPs比DANPs更容易進入A549細胞內。
  實驗結論
  1.成功地構建了PEG化多西他賽白蛋白納米粒;
  2.PEG-DANPs粒徑合適,分布均勻穩(wěn)定,載藥量及包封率良好,具有明顯的緩釋效應,對機體紅細胞有較低的破壞作用;
  3.PEG-DANPs能夠更好地進入A549細胞,能夠有效地抑制A549細胞的增殖并誘導其凋亡;
  4.PEG-DANPs能夠有

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