DKK4促進肺癌多西他賽耐藥及其機制研究.pdf

1、肺癌是臨床上最為常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率及致死率較高，嚴重威脅患者健康。大多患者就診時已至晚期，無手術機會，多采用化療為主的綜合治療。多西紫杉醇（又名多西他賽）在非小細胞肺癌化療中都有良好的臨床療效，但是其耐藥問題是化療失敗和腫瘤復發(fā)的重要原因。因此研究其耐藥的分子機制，對提高患者生存期和改善預后具有重要意義。
　　DKK4是Dickkopf家族蛋白的一種，定位于染色體8p11.2-p11.1，是一種分泌性糖蛋白，通過抑制Wn

2、t/β-catenin信號通路的活性，實現(xiàn)其生物學行為。DKK4與腫瘤的發(fā)生密切相關，在結腸癌、腎癌組織中高表達，但DKK4與肺癌的關系不是非常清楚。
　　本研究首先分析了耐藥/親本細胞株的表達譜，對比肺癌A549多西他賽耐藥株與親本株A549的差異基因，發(fā)現(xiàn)表達水平差別在倍以上的差異表達基因共有392個。其中，A549多西他賽耐藥株中DKK4表達比親本株上調(diào)5倍，驗證了DKK4在A549/DTX細胞中高表達。然后進行了體外驗證D

3、KK4表達水平與多西他賽耐藥的相關性，結果顯示A549/DTX細胞干涉DKK4后檢測喪失多西他賽耐藥性，過表達DKK4后，A549細胞耐藥性增強，進一步證實DKK4與肺癌多西他賽耐藥密切相關。在下一步的研究中，我們對DKK4促進肺癌A549多西他賽耐藥作用機制進行初步研究，結果顯示:DKK4高表達抑制JNK，干涉DKK4通過活化JNK促進casepase3活化引起細胞凋亡，干涉DKK4通過活化JNK抑制Bcl-2表達從而引起細胞凋亡，同

4、時A549/DTX細胞通過高表達DKK4促進克隆形成以及增強細胞遷移能力，造成細胞對DTX耐藥。
　　綜上所述，本研究首次對DKK4與肺癌多西他賽耐藥相關性進行了實驗研究，并對其機制進行了初步研究，意義在于為肺癌治療提供新的治療靶點和新的治療策略。
　　第一部分 A549/DTX細胞中DKK4表達情況研究
　　目的:證實A549/DTX細胞中DKK4高表達。
　　方法:Realtime PCR實驗測定A549/

5、DTX細胞株中DKK4 mRNA水平;Westernblot檢測DKK4蛋白水平檢測;ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中DKK4的表達.
　　結果:與親本株相比，DKK4在A549/DTX細胞中表達明顯增高。
　　結論:DKK4在A549/DTX細胞中高表達，提示DKK4可能與肺腺癌多西他賽耐藥相關。
　　第二部分 體外DKK4表達水平與多西他賽耐藥呈正相關的研究
　　目的:體外驗證DKK4表達水平與多西他賽耐藥的相

6、關性
　　方法:首先驗證A549/DTX細胞干涉DKK4后喪失多西他賽耐藥性。用siRNA抑制DKK4表達，用MTT檢測各實驗組腫瘤細胞抑制率及測定半數(shù)致死劑量(IC50)。流式檢測SiRNA轉(zhuǎn)染干涉DKK4后DTX誘導的A549/DTX細胞凋亡情況。然后過表達DKK4，用Real-time PCR檢測DKK4 mRNA過表達差異，MTT法測定DTX對肺癌A549過表達DKK4后細胞的IC50。
　　結果: MTT檢測結果表

7、明:SiRNA轉(zhuǎn)染干涉DKK4對肺癌A549/DTX細胞抑制率顯著提高。IC50顯著降低。Si-RNA轉(zhuǎn)染干涉DKK4促進DTX誘導的A549/DTX細胞凋亡。過表達DKK4結果表明，轉(zhuǎn)染干涉DKK4對肺癌A549細胞DTX的IC50明顯升高。
　　結論:本研究結果表明:A549/DTX細胞干涉DKK4后檢測喪失多西他賽耐藥性，過表達DKK4后，A549細胞耐藥性增強，進一步證實DKK4與肺腺癌多西他賽耐藥呈正相關。
　　第

8、三部分 DKK4作用的分子機制研究
　　目的:揭示DKK4促進A549/DTX細胞對多西他賽耐藥的分子機制
　　方法:采用Western blot檢測信號通路磷酸化，平板克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞體外增殖能力，用Transwell法檢測細胞侵襲能力。
　　結果:Western blot檢測提示干涉DKK4可促進JNK磷酸化，Realtime PCR檢測結果:JNK抑制劑PD600125部分恢復干涉DKK4引起B(yǎng)cl-

9、2表達下調(diào)。JNK抑制劑PD600125部分阻斷干涉DKK4引起的細胞凋亡。平板克隆形成實驗結果:A549/DTX細胞通過高表達DKK4促進克隆形成以及細胞遷移能力。Transwell法檢測結果:A549/DTX-SiRNA侵襲細胞數(shù)明顯減少。
　　結論:(1) DKK4高表達抑制JNK，干涉DKK4通過活化JNK促進casepase3活化引起細胞凋亡，干涉DKK4通過活化JNK抑制Bcl-2表達從而引起細胞凋亡。(2)A549/