大連市人腸道病毒71型病原學特征研究.pdf

1、目的:了解2009～2011年大連地區(qū)EV71流行情況;對分離出的EV71毒株進行部分基因片段的核苷酸和氨基酸序列測定，構建系統(tǒng)發(fā)生樹和同源性分析，以確定其基因型別;對與毒株毒力相關基因序列進行比較分析，探尋毒株毒力與基因序列之間的關系，為今后EV71的防治及防控提供科學依據(jù)。
　　 方法:收集大連市手足口病監(jiān)測哨點醫(yī)院門診就診病例和手足口樣病例，將來自監(jiān)測哨點醫(yī)院的咽拭子和糞便標本用熒光RT-PCR方法檢測為EV71的陽性標本

2、接種于RD細胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)后分離EV71病毒，提取病毒RNA，利用RT-PCR方法分別擴增出VP1、VP4、5'UTR基因片斷，對擴增產(chǎn)物進行核苷酸序列測定，用DNAStar軟件與EV71各基因亞型代表株進行序列比較，分析其核苷酸序列和氨基酸序列的同源性，以及不同臨床癥狀的毒株與核苷酸和氨基酸序列之間的關系。
　　 結果:
　　 1、2009～2011年期間共檢測533份樣品，其中EV71陽性333份，陽性率為62.48

3、％。533份病例中，男317例，女216例，男女比例為1.47∶1。其中男性患者EV71陽性率為61.51％，女型患者EV71陽性率為63.89％。0～5歲為手足口病高發(fā)年齡，以托幼兒童為主。
　　 2、VP1區(qū)序列分析表明:選取9株RD細胞分離培養(yǎng)的EV71毒株進行VP1序列擴增并測序，其結果用DNAStar軟件分析，這9株EV71毒株均屬于C4a亞型，其核苷酸之間的同源性為88.7％～99.9％;氨基酸之間的同源性為96.7

4、％～100％。與BRCR-CA-70的核苷酸同源性為79.4％～81.5％;與B型核苷酸同源性為:81.8％～84.7％;與C亞型核苷酸同源性為85.2％～99.2％，而與C4同源性高達90.0％～99.2％，其中與C4a的同源性最高為93.7％～99.2％，與C4b的同源性為90.0％～94.1％。對重癥來源的毒株，在第227位核苷酸發(fā)生了T→C的堿基置換，而輕癥來源的毒株均未發(fā)生改變。對于氨基酸序列比較上未發(fā)現(xiàn)一致性改變。
　

5、　 3、VP4區(qū)序列分析表明:9株毒株的VP4氨基酸序列高度一致，只是在第52位dalian1-09株發(fā)生了K→R的改變，第62位氨基酸dalian4-10株發(fā)生了T→S的改變，其余各株氨基酸序列均一致。沒有發(fā)現(xiàn)重癥來源的毒株和輕癥來源的毒株在氨基酸或核苷酸序列上相應固定的變異。
　　 4、5'UTR區(qū)序列分析表明:9株毒株在第208位核苷酸，重癥來源的樣品發(fā)生了堿基置換(G→A);在第254位核苷酸，重癥來源的樣品發(fā)生了堿基

6、置換(A→G)。氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)一致性改變。
　　 結論:
　　 1、2009年-2011年大連地區(qū)手足口病的主要病原體為EV71，其基因型別為C4a亞型，這與中國大陸的大部分地區(qū)流行株相一致。
　　 2、基于VP4的基因分型與VP1的基因分型相一致，均為C4a亞型，且VP4序列高度保守。
　　 3、在毒株的毒力分析上，重癥來源的毒株，在VP1的第227位核菅酸發(fā)生了T→C的堿基置換，而輕癥來源的毒株均未