腸道病毒71型病毒樣顆粒的制備、純化與鑒定.pdf

1、手足口病是嬰幼兒的一種常見傳染病。EV71是引起患者手足口病的主要病原體之一,同時(shí)還能引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病,嚴(yán)重威脅了兒章的生命健康,預(yù)防EV71的流行十分重要。據(jù)統(tǒng)計(jì),2009年我國共報(bào)告手足口病病例約115.5萬例(不含港、澳、臺(tái)),死亡病例353例,占我國丙類傳染病發(fā)病數(shù)第一位。至今尚無有效的針對(duì)性的疫苗預(yù)防EV71的感染,只能提高監(jiān)測(cè)的強(qiáng)度和靈敏度,早發(fā)現(xiàn),早治療。因此研制針對(duì)

2、EV71的預(yù)防性疫苗對(duì)控制嬰幼兒手足口病的流行具有十分重要的意義。
　　 本課題選擇利用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)發(fā)酵表達(dá)EV71 VLP。首先參照釀酒酵母基因中的優(yōu)勢(shì)密碼子,運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)EV71 P1和3CD基因進(jìn)行設(shè)計(jì)和全基因合成。將合成的基因序列克隆到釀酒酵母表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)化釀酒酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)擴(kuò)增EV71 VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)基因,克隆到釀酒酵母表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)化釀酒酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。其次,對(duì)誘導(dǎo)后的酵母

3、細(xì)胞進(jìn)行破碎,利用蛋白沉淀、氯化銫密度梯度離心等純化方法初步純化分離VLP。對(duì)純化后樣品進(jìn)行Western Blot檢測(cè)鑒定;并通過負(fù)染電鏡觀察VLP。
　　 本課題利用兩種方法在釀酒酵母中表達(dá)EV71 VLP:1.將VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)基因共同轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,可以在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá),并自行組裝成VLP。2.P1和3CD蛋白可以在釀酒酵母中成功表達(dá),蛋白酶3CD將P1蛋白切割成VP1、VP2、VP3和VP4,后者在