二聚體突變引物定量PCR技術(shù)的研發(fā)及其臨床應(yīng)用.pdf

1、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)技術(shù)分為內(nèi)摻式染料技術(shù)和探針技術(shù)兩類。內(nèi)摻式染料技術(shù)方法簡(jiǎn)單，成本較低，但特異性差，故不適于臨床檢測(cè)。探針技術(shù)采用了基于熒光淬滅原理或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonance energy transfer，F(xiàn)RET)的探針，包括TaqMan探針、Amplifluor探針、分子信標(biāo)、蝎型探針等。這些

2、探針均是在與模板互補(bǔ)的同一寡核苷酸鏈上，分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，特異性高，定量準(zhǔn)確，因而被廣泛應(yīng)用于臨床診斷中。但這些探針均屬于多標(biāo)記探針，其合成難度和成本較高，制約了其推廣應(yīng)用。不少研究人員試圖采用單標(biāo)記探針來降低合成難度和成本，如雜交探針(hybridization probes)和熒光置換探針(displacing probes)，取得了較好效果。但為防止探針與靶序列雜交引起自身延伸而被破壞，仍然需要在探針末端磷酸化來阻斷其延

3、伸，因此，并非真正意義的單標(biāo)記探針技術(shù)。
　　 基于上述分析，本課題設(shè)計(jì)了一種全新的二聚體突變引物，其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，為真正意義的單標(biāo)記探針。與其它多標(biāo)記熒光探針相比，二聚體突變引物有以下優(yōu)點(diǎn)：
　　 1.結(jié)構(gòu)上具有天然的“熱啟動(dòng)”功能，增加了方法的特異性；
　　 2.熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)空間距離近，報(bào)告基團(tuán)可被有效抑制，降低了方法的本底，一旦擴(kuò)增開始兩者便徹底分離，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)，增加了方法的靈敏度；

4、>　　 3.真正實(shí)現(xiàn)熒光探針的單標(biāo)記，降低了合成、純化難度，因此降低了成本。
　　 這種新型定量檢測(cè)系統(tǒng)既具有染料法對(duì)新生雙鏈DNA均能示蹤、成本低的特點(diǎn)，又具有探針法高特異性，是一種高通用性、高特異性和靈敏性、操作簡(jiǎn)單、價(jià)廉的新型real-time PCR技術(shù)。
　　 我們選取乙型肝炎病毒和沙眼衣原體為具體研究對(duì)象，系統(tǒng)地對(duì)二聚體突變引物技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)和臨床應(yīng)用價(jià)值評(píng)價(jià)。證實(shí)二聚體突變引物技術(shù)具有高靈敏度、寬線性范圍

5、、重復(fù)性好、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床病原體檢測(cè)或流行病學(xué)調(diào)查研究。
　　 第一部分、新型二聚體突變熒光引物定量PCR檢測(cè)HBV方法的建立及臨床應(yīng)用
　　 目的：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)DNA定量檢測(cè)的方法多為TaqMan探針技術(shù)，該技術(shù)具有敏感度高和特異性好等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于臨床。但是TaqMan探針技術(shù)有兩個(gè)明顯的缺點(diǎn)：一是報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)同時(shí)標(biāo)記同一寡核苷酸鏈的兩端，合成與純化

6、難度較大，導(dǎo)致成本較高；二是必須通過Taq水解酶延伸水解探針，造成檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。我們將報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別標(biāo)記在互補(bǔ)的兩條單鏈寡核苷酸上，設(shè)計(jì)出二聚體突變引物探針，以克服TaqMan探針標(biāo)記和純化難度大等缺點(diǎn)，降低成本；另一方面在檢測(cè)步驟上可省去酶水解過程，縮短檢測(cè)時(shí)間。本文欲建立一種基于該二聚體突變引物的快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉、操作簡(jiǎn)單的HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)方法。
　　 方法：根據(jù)HBV基因組保守區(qū)域precore/c

7、ore設(shè)計(jì)二聚體突變引物，用PMD-18T系統(tǒng)構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化定量PCR體系。采用5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品系列，分別測(cè)定其批內(nèi)變異系數(shù)(CV)和批間變異系數(shù)(CV)；系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒通過概率分析檢測(cè)其靈敏度；采用確診的非乙肝病毒性肝炎患者標(biāo)本30例，其中甲肝5例、丙肝20例、戊肝5例，以及30例健康志愿者血清評(píng)價(jià)其特異性；所有病例乙肝血清標(biāo)志物無異常且丁肝抗體陰性，健康志愿者HBsAg陰性并且血清ALT水平正常。病例組收集乙肝病人或者乙

8、肝攜帶者標(biāo)本共211例，根據(jù)乙肝血清免疫標(biāo)志物和ALT水平，將所有病例分為4組：41份HBsAg陽性標(biāo)本(ALT持續(xù)升高)，42份抗HBe抗體陽性標(biāo)本(ALT持續(xù)升高)，36份抗HBe抗體陽性標(biāo)本(ALT正常)，85份HBsAg陽性無癥狀攜帶者標(biāo)本(ALT正常)。對(duì)上述211例標(biāo)本同時(shí)以本法及達(dá)安公司HBV定量PCR檢測(cè)試劑盒法測(cè)定HBV DNA水平，進(jìn)行方法學(xué)對(duì)比。通過ROC曲線評(píng)價(jià)本方法對(duì)乙肝患者和攜帶者的鑒別診斷能力。另外，為評(píng)價(jià)

9、本法在乙肝治療過程中的監(jiān)測(cè)作用，我們選用1例慢性乙肝急性復(fù)發(fā)病人，采用本法監(jiān)測(cè)病人在抗病毒治療期間變化，與血清ALT水平聯(lián)合評(píng)價(jià)患者對(duì)抗病毒治療的反應(yīng)。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品的含有HBV保守序列的重組質(zhì)粒；建立了利用二聚體突變熒光引物的熒光定量PCR方法。該方法在102～107copies/ml范圍內(nèi)具有良好的線性(R2=0.994)，最低檢測(cè)限為56 copies/ml，特異性為100％，批內(nèi)CV在0.70％

10、～7.8％之間，批間CV在0.78％～9.02％之間。本法的HBV DNA定量結(jié)果與達(dá)安公司試劑盒定量結(jié)果具有明顯的相關(guān)性(R2=0.95)。ROC曲線下面積為0.977，區(qū)分乙型肝炎患者和乙型肝炎攜帶者的cut-off值為1240copies/ml，特異性為96.3％，靈敏度為100％，具有很好的臨床診斷性能。各組病人的HBV DNA含量通過回歸分析比較，發(fā)現(xiàn)各組間具有顯著差異，HBV DNA定量檢測(cè)數(shù)據(jù)可作為對(duì)病人病情嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià)

11、指標(biāo)。本法監(jiān)測(cè)病人抗病毒治療期間的HBV DNA水平變化與血清ALT水平變化趨勢(shì)一致，但可比ALT更早預(yù)測(cè)病人抗病毒治療的效果。
　　 結(jié)論：本文建立了基于二聚體突變引物為基礎(chǔ)的新型HBV DNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，可為臨床對(duì)乙肝病人進(jìn)行診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷提供可靠的定量數(shù)據(jù)，并可進(jìn)一步開發(fā)為檢測(cè)試劑盒。
　　 第二部分、新型二聚體突變引物定量檢測(cè)沙眼衣原體方法的建立
　　 目的：檢測(cè)沙眼衣原體(Chla

12、mydia trachomatis，CT)的方法有細(xì)胞培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法，前者操作復(fù)雜、靈敏度低，后者靈敏度不高，特異性差，兩者在臨床應(yīng)用均受限制。目前多使用分子診斷技術(shù)檢測(cè)沙眼衣原體，具有靈敏度度高和特異性好等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于臨床。但是，常用的TaqMan探針技術(shù)存在成本較高、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。本部分內(nèi)容擬建立比TaqMan探針技術(shù)性能更加優(yōu)越的二聚體突變引物技術(shù)用于臨床定量檢測(cè)沙眼衣原體。
　　 方法：以我們前期構(gòu)建含CT

13、主要外膜蛋白(major outer membraneprotein，MOMP)部分序列的重組質(zhì)粒作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)計(jì)二聚體突變引物，優(yōu)化定量PCR體系。采用4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品系列計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(CV)和批間變異系數(shù)(CV)判斷方法的重復(fù)性；采用肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體、15種標(biāo)準(zhǔn)血清型CT及多種生殖道常見病原體對(duì)其特異性進(jìn)行測(cè)定；兩種FDA認(rèn)證的分子診斷方法(羅氏和雅培沙眼衣原體定量檢測(cè)試劑盒)分別對(duì)148例臨床生殖道標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以新的

14、CT“擴(kuò)大金標(biāo)準(zhǔn)”為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)本檢測(cè)方法的臨床檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：建立了二聚體突變熒光引物的定量PCR方法，其線性范圍為101～109 copies/μl，靈敏度為10 copies/μl；特異性為100％；低濃度樣品的批內(nèi)重復(fù)性CV為4.71％，批間CV為5.57％；高濃度樣品的批內(nèi)CV為3.20％，批間CV為3.66％；能夠檢測(cè)出所有血清型沙眼衣原體，而其他常見生殖道病原菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性；對(duì)確診的148份臨