維生素C發(fā)酵中山梨醇代謝相關基因研究.pdf

1、中國維生素C(Vc)生產(chǎn)目前主要采取3株菌參與的兩步發(fā)酵工藝，即葡糖桿菌負責將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖（醇糖轉(zhuǎn)化），再由酮古龍酸菌和芽孢桿菌組成的混菌體系完成從L-山梨糖高效轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸（糖酸轉(zhuǎn)化）。經(jīng)過多年的育種和工藝優(yōu)化，Vc兩步發(fā)酵無論在菌種和工藝方面都已達到相當高的水平，進一步提升的空間已很有限。將醇糖轉(zhuǎn)化和糖酸轉(zhuǎn)化的功能整合到同一株菌中實現(xiàn)從醇到酸的一步發(fā)酵是目前國內(nèi)外Vc工藝改造的發(fā)展趨勢，可望簡化發(fā)酵工藝、

2、縮短發(fā)酵周期、減少能源和基質(zhì)消耗，大幅度降低Vc生產(chǎn)成本，提升Vc生產(chǎn)工藝水平。
　　本實驗室長期從事Vc兩步發(fā)酵的分子生物學研究，完成了兩步發(fā)酵重要菌株葡糖桿菌和酮古龍酸菌的基因組序列分析，闡明了產(chǎn)酸的關鍵基因，通過導入產(chǎn)酸基因在葡糖桿菌中實現(xiàn)了由醇到糖的一步轉(zhuǎn)化。目前5L發(fā)酵罐培養(yǎng)產(chǎn)酸達20.4g/L，但轉(zhuǎn)化率還不足10％。為了闡明山梨醇代謝途徑和相關基因的功能，從而加強限速步驟，阻斷代謝旁路，我們對山梨醇代謝的相關基因進行了

3、研究。
　　利用添加和不添加山梨醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)葡糖桿菌H24，通過反轉(zhuǎn)錄和高通量測序比較了兩種培養(yǎng)條件下菌體轉(zhuǎn)錄組的差異，結(jié)合文獻報道初步確定與山梨醇產(chǎn)糖及產(chǎn)酸相關的酶包括3種山梨醇脫氫酶(S LDH)、山梨糖脫氫酶(SDH)、山梨酮脫氫酶(SNDH)和艾杜糖酸脫氫酶KGR，與旁路代謝相關的酶包括3種酮古龍酸還原酶(HADH)、3種山梨糖還原酶(SR)和木糖醇脫氫酶(XDH)。分別對以上基因進行了克隆、表達與活性分析，發(fā)現(xiàn)在3種酮

4、古龍酸還原酶(HADH)，其中HADH1活性最強，推測在H24中HADH1負責將酮古龍酸轉(zhuǎn)化為L-艾杜糖酸，酮古龍酸還原酶的存在抑制了酮古龍酸(2-KGA)的積累，降低了2-KGA的產(chǎn)率，在Vc生產(chǎn)中2-KGA是Vc的前體，從而降低了Vc的產(chǎn)量。
　　嘗試采用同源重組方法對某些關鍵基因進行了敲除。為建立特異基因無痕敲除操作系統(tǒng)，探索了尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（upp）在基因敲除技術中的應用，upp是一種反向篩選標記基因，在特定的條

5、件下篩選，不含有標記基因upp的菌株卻能夠存活下來，從而可望實現(xiàn)在不引入抗性基因又達到了篩選的目的。構建了旁路基因的敲除載體，對山梨糖還原酶SR、酮古龍酸還原酶HADH和山梨醇脫氫酶SLDH進行了敲除，并成功獲得了sr3的缺陷株，對山梨糖還原酶SR3進行了評價，發(fā)現(xiàn)山梨糖還原酶缺陷菌株在山梨醇、山梨糖、酵母粉碳源中生長的速度都遠遠高于野生菌株。
　　對酮古龍酸菌SDH在異源宿主中進行了表達。通過對連接不同啟動子的SDH在異源宿主中