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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
目前生產(chǎn)維生素C(Vitamin c,Vc)的主要方法為我國(guó)上世紀(jì)70年代首創(chuàng)的Vc二步發(fā)酵法。兩步發(fā)酵法需通過(guò)兩次發(fā)酵及三種微生物的共同作用,存在發(fā)酵工藝復(fù)雜和微生物代謝污染等問(wèn)題,目前Vc生產(chǎn)工藝發(fā)展的主流方向是將兩步發(fā)酵簡(jiǎn)化為一步單菌發(fā)酵。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中,通過(guò)在負(fù)責(zé)醇糖轉(zhuǎn)化的氧化葡糖桿菌中導(dǎo)入產(chǎn)酸基因簇實(shí)現(xiàn)了由D-山梨醇到2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KGA)的一步單
2、菌發(fā)酵,但醇酸轉(zhuǎn)化率較低。本課題對(duì)山梨醇相關(guān)基因及代謝途徑進(jìn)行了研究,嘗試通過(guò)增強(qiáng)主路代謝和阻斷旁路代謝兩方面來(lái)提高一步菌醇酸轉(zhuǎn)化率。
方法:
(1)選取了四種常用和一種文獻(xiàn)報(bào)道的氧化葡糖桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子,同時(shí)通過(guò)氧化葡糖桿菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序選取了轉(zhuǎn)錄水平最高的三種啟動(dòng)子,構(gòu)建山梨糖脫氫酶山梨酮脫氫酶表達(dá)載體,電擊轉(zhuǎn)化氧化葡糖桿菌比較2-KGA產(chǎn)量。
(2)根據(jù)基因組注釋和轉(zhuǎn)錄組差異分析并結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研預(yù)測(cè)了12種可能
3、參與山梨醇代謝的基因,包括3種山梨醇脫氫酶(SLDH)、3種山梨糖還原酶(SR)、3種木糖醇脫氫酶(XDH)和3種酮古龍酸還原酶(HADH),通過(guò)課題組建立的快速高效同源重組法對(duì)這些酶的編碼基因進(jìn)行一敲除,分別以山梨醇、山梨糖為碳源對(duì)敲除菌進(jìn)行生長(zhǎng)及糖酸代謝水平評(píng)價(jià)。選擇表型變化大的敲除菌進(jìn)行基因回補(bǔ)。部分敲除菌導(dǎo)入山梨糖脫氫酶山梨酮脫氫酶表達(dá)載體,比較基因敲除前后菌株醇糖代謝及2-KGA產(chǎn)量的變化。同時(shí),為建立基因無(wú)痕敲除操作系統(tǒng)以實(shí)
4、現(xiàn)多個(gè)相關(guān)基因的敲除,對(duì)upp基因進(jìn)行敲除及回補(bǔ)工作,通過(guò)Tn5轉(zhuǎn)座突變篩選其他未知的與旁路代謝相關(guān)基因。
結(jié)果:
(1)在試管及搖瓶中培養(yǎng),PcsbD啟動(dòng)子與天然啟動(dòng)子相比產(chǎn)酸量分別提高15%和19%。
(2)目前已分別在氧化葡糖桿菌H24和1.637中成功敲除了10個(gè)和11個(gè)基因。分別以山梨醇、山梨糖為碳源對(duì)敲除菌進(jìn)行評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),敲除菌H24Δsr3以山梨糖為碳源時(shí)前期生長(zhǎng)緩慢,而敲除菌1.637Δsr3
5、在兩種碳源中前期生長(zhǎng)緩慢;H24和1.637的sr1、sr2、sr3敲除菌以山梨醇為碳源時(shí)山梨糖的積累增多,其中1.637Δsr3敲除菌山梨糖積累最多,1.637Δsr3的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明sr3基因影響菌體生長(zhǎng)及山梨糖利用。導(dǎo)入山梨糖脫氫酶山梨酮脫氫酶表達(dá)載體后,1.637Δsr3產(chǎn)酸量高于野生菌1.637。
(3)完成了氧化葡糖桿菌upp基因敲除及回補(bǔ),構(gòu)建pBBR1MCS5-sndhsdh/1.637重組菌株Tn5突
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